Cartilage humain et chondrocytes
Les prélèvements d’échantillons de cartilage humain ont été effectués conformément aux protocoles approuvés par le comité d’éthique de l’hôpital Sir Run Run Shaw (Hangzhou, Chine) et les méthodes ont été réalisées conformément aux directives approuvées. Tous les sujets ont signé un consentement éclairé écrit. Des échantillons de cartilage humain ont été prélevés sur des patients ayant subi une arthroplastie totale du genou (n= 10). Les critères d’exclusion des patients sont détaillés en référence. 21. Le genou était un site cible important pour l’arthrose, l’articulation tibio-fémorale médiale était la plus touchée et l’arthrose de l’articulation tibio-fémorale latérale isolée était relativement rare.44. Les lésions sur le plateau tibial médial (MTP) étaient plus évidentes que le plateau tibial latéral (LTP). Par conséquent, ces deux zones de tissus cartilagineux ont été collectées pour une analyse ultérieure. Des chondrocytes humains et des chondrocytes de lapin ont été récoltés à partir de cartilage humain et de lapin. Les détails ont été rapportés en référence. 21. Les chondrocytes ont été maintenus dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pendant 24 h à 37 °C. Les cellules ont été filtrées à travers un tamis cellulaire de 0,075 mm et lavées avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) avant la culture ou l’isolement des miARN/ARNm. Des chondrocytes primaires à 80% de confluence ont été utilisés pour les expériences. Pendant la période de culture, les cellules ont été incubées à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 et 95 % d’air.
Un lapin modèle d’arthrose
Tous les lapins (lapins blancs néo-zélandais mâles de 12 mois, pesant 2,5 à 3 kg) ont été achetés dans le champ de lapins de Xin Jian (certificat n° SCXK, Zhejiang, 2015-0004, Chine). Un total de 32 lapins ont été utilisés dans des expériences in vivo. Tel que rapporté par Yoshioka et al45, une chirurgie de transection du ligament croisé antérieur (ACLT) a été réalisée pour induire un modèle d’arthrose post-traumatique. En bref, une incision parapatellaire médiale a été réalisée et une arthrotomie a été opérée. La rotule était luxée latéralement et le genou complètement fléchi. Le ligament croisé antérieur (LCA) a été exposé et sectionné avec une lame n ° 12 (figures supplémentaires S1a et b). Pour confirmer que la chirurgie ACLT, nous avons effectué le test de dessin antérieur après chaque procédure. L’articulation a été lavée avec une solution saline stérile puis refermée. L’articulation bilatérale du genou a été réalisée par chirurgie ACLT. Après l’opération, les lapins pouvaient se déplacer librement dans la cage sans immobilisation. 24 lapins ont subi l’opération ACLT et les 8 autres ont subi une opération simulée (comme groupe témoin). Le virus c (AAV) CircFNDC3B WT et Mut ont été achetés auprès de HanBio (Shanghai, Chine). Les 32 lapins ont été répartis au hasard en 4 groupes de 8 lapins par groupe (groupe de chirurgie de la honte avec injection de solution saline, groupe de chirurgie ACLT avec injection de solution saline, groupe de chirurgie ACLT avec injection de virus CircFNDC3B WT, groupe de chirurgie ACLT avec injection de virus CircFNDC3B Mut), et chacun lapin a été élevé dans une seule cage. Après l’opération, les lapins se sont reposés pendant une semaine. Ensuite, les cavités articulaires du genou des lapins ont été injectées avec un total de 100 µl de solution saline ou de solution virale (environ 1 × 108 UFP/mL). Après 7 semaines, tous les lapins ont été sacrifiés et les articulations du genou ont été isolées pour des recherches ultérieures. La chronologie de toute l’expérience sur le lapin a été visualisée (figure supplémentaire S1c). L’élevage et les expériences ont été effectués strictement avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut des sciences de la santé (Zhejiang, Chine).
Coloration verte safranine O-fast et score OARSI
Les spécimens de cartilage ont été fixés et décalcifiés, puis sectionnés à 5 μm, et chaque 10ème section a été colorée avec une solution de safranine O Sigma-Aldrich et une solution Fast Green (St. Louis, MO, USA). Le score OARSI (Osteoarthritis Research Society International) était basé sur la coloration verte rapide à la safranine O19les détails ont été rapportés en référence. 21.
Test pull-down d’ARN avec sonde CircFNDC3B biotinylée
Ce test a été effectué selon l’instrument à l’aide du kit de pulldown d’ARN (BersinBio, Guangzhou, Chine) et la sonde CircFNDC3B biotinylée a été conçue et synthétisée par RiboBIO (Guangzhou, Chine). Les détails ont été rapportés en référence. 46Les échantillons d’ARN finaux ont été soumis par RT-qPCR pour la détection.
Analyse bioinformatique
TargetScan, RNAhybrid et miRanda47,48,49 ont été utilisés pour prédire la cible du circRNA. TargetScan, miRDB et PITA ont été utilisés pour prédire la cible des miARN comme décrit19. Les gènes liés à l’arthrose ont été obtenus à partir de la base de données NCBI Gene.
Extraction d’ARN et analyse PCR quantitative en temps réel
L’ARN cellulaire total a été extrait des chondrocytes cultivés à l’aide du réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conformément aux instructions du fabricant. Les niveaux de miARN ont été extraits à l’aide du kit d’isolation de miARN (Ambion). L’ARN a été stocké à -80 ° C. La transcription inverse a été réalisée à l’aide de 1,0 µg d’ARN total et d’un kit d’ADNc miARN ou d’un kit d’ADNc HiFiScript (CWBIO, Pékin, Chine), qui ont été utilisés pour étudier l’expression de miARN et d’ARNm, respectivement. La PCR en temps réel de quantification a été réalisée à l’aide du Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (Yeason Biotech, Chine) et analysée sur un système de détection de séquençage ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis). Toutes les amorces impliquées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S1.
Inactivation et surexpression de l’ARN
De petits ARN interférents (siRNA) ciblant le CircRNA (CircFNDC3B) ou l’ARNm (HO-1), ainsi que le mimique ou l’inhibiteur de miRNA (miR-525-5p) ont été achetés auprès de Ribobio (Guangzhou, Chine). Le vecteur de surexpression de CircFNDC3B a été construit par Tsingke (Pékin, Chine) en utilisant le vecteur plasmidique pc016: pcDNA3.1-CMV-circRNA-Zsgreen. La transfection des cellules avec des plasmides a été réalisée en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine 3000 (ThermoFisher). Les siARN, les inhibiteurs et les mimiques ont été transfectés à l’aide du réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher).
Test de rapporteur à double luciférase
Le test de rapporteur de luciférase a été utilisé pour déterminer la liaison entre le circARN et le miARN, ou entre le miARN et l’ARNm. Les vecteurs rapporteurs de la luciférase (vecteur plasmidique : hFLuc-XbaI-hRLuc) ont été conçus et achetés auprès de Genechem (Shanghai, Chine). La séquence 3ʹUTR de CircFNDC3B ou HO-1 et leurs mutants ont été insérés dans les sites de restriction XbaI des vecteurs rapporteurs de la luciférase. La description détaillée a été rapportée en référence. 50. Les expériences ont été répétées indépendamment trois fois.
Western blot
Des chondrocytes humains ou de lapin ont été lysés avec un tampon RIPA (Beyotime, Chine), les protéines ont été collectées, la concentration en protéines a été déterminée par analyse BCA (Beyotime, Chine). SDS-PAGE a séparé la protéine cellulaire totale, qui a ensuite été transférée sur une membrane Immobilon-P (taille des pores de 0, 2 μm, Millipore, Billerica, MA, USA). Les membranes ont été bloquées puis incubées avec des anticorps primaires (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) pendant une nuit à 4 ° C, puis incubées avec des anticorps secondaires pendant 1 h. L’imagerie a été réalisée avec FDbio-Femto ECL (Fudebio, Hangzhou, Chine) et un système de chimiluminescence (Bio-Rad, États-Unis), l’analyse a été effectuée à l’aide du logiciel Image Lab. Les anticorps que nous avons utilisés ont été répertoriés dans le tableau supplémentaire S2. En particulier, selon la société de fabrication, le site de reconnaissance MMP13 est un peptide synthétique dans la MMP13 humaine (terminal C) et le site de reconnaissance MMP3 est un peptide synthétique dans la MMP3 humaine aa 450 à l’extrémité C-terminale (terminal C). Les expériences ont été répétées indépendamment trois fois.
Immunofluorescence
Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, imprégnées de tritonX-100 à 0,5 % pendant 30 min et bloquées avec de l’albumine de sérum bovin (BSA) à 5 % pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires (dilués au 1/100 par BSA) à 4 °C pendant une nuit, lavées trois fois avec du PBS et incubées avec des anticorps secondaires conjugués au CL594 ou CL488 (Proteintech Group, Rosemount, IL, USA, dilué 1 : 200 par BSA) à température ambiante pendant 1 h. Enfin, après trois lavages au PBS, les noyaux ont été colorés au DAPI. Toutes les opérations, à commencer par l’incubation des anticorps secondaires, ont été réalisées dans l’obscurité. Toutes les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence (Eclipse E600; Nikon Corporation, Tokyo, Japon). Les anticorps que nous avons utilisés ont été répertoriés dans le tableau supplémentaire S2.
Immunohistochimie
Des spécimens de cartilage ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pour l’inclusion de paraffine et sectionnés à 5 μm. Les sections ont été incubées avec un anticorps primaire à 4 ° C pendant la nuit, lavées trois fois avec du PBST et incubées avec un anticorps secondaire (Beyotime Institute of Biotechnology, Inc., Jiangsu, Chine) pendant 2 h à température ambiante.
Hybridation in situ fluorescente d’ARN (FISH)
Le test FISH a été effectué dans des HC ou des tissus de lapin. Les sondes CircFNDC3B marquées au Cy3 et les sondes miR-525-5p d’acide nucléique verrouillé marquées au 488 ont été conçues et synthétisées par RiboBio (Guangzhou, Chine). Le kit RiboBio FISH (Guangzhou, Chine) a été utilisé conformément au manuel d’instructions. Les images ont été obtenues sur le microscope confocal à balayage laser Nikon A1Si (Nikon Instruments Inc, Japon).
Mesure du niveau de ROS
Le kit de test Beyotime Biotech (Chine) ROS a été utilisé pour déterminer les niveaux de ROS intracellulaires. Après traitement, les chondrocytes ont été récoltés et lavés deux fois avec du PBS. Ensuite, les chondrocytes ont été centrifugés et le surnageant a été jeté. Enfin, les chondrocytes ont été incubés avec DCFH-DA (10 mmol/L) à 37 °C pendant 30 min dans une chambre noire pour analyse par cytométrie en flux.
Essai de viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide du kit de comptage de cellules-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japon). Les chondrocytes ont été ensemencés dans des plaques de 96 puits à une densité de 3 × 103 / bien en triple exemplaire. La CCK-8 a été ajoutée aux puits à 24, 48, 72 et 96 heures après la transfection. Un lecteur de microplaques réglé à 450 nM (DO450) a été utilisé pour mesurer les valeurs d’absorbance de la densité optique (DO) dans chaque puits. Les expériences ont été répétées indépendamment trois fois.
analyses statistiques
Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de SPSS 22.0. Signification statistique (P< 0,05) a été déterminée par ANOVA et test t de Student, sauf indication contraire.
Résumé des rapports
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.
