Synthèse du bispyridyl polyéthylène glycol (bispyridyl PEG)
Dans un flacon Schlenk de 50 ml équipé d’un barreau magnétique, ont été ajoutés [3,5-di(pyridine-4-yl)phenyl]méthanol (2,5 g, 9,54 mmol), anhydride succinique (1,15 g, 11,5 mmol) et 4-diméthylaminopyridine (1,4 g, 11,5 mmol). Le ballon a été bouché avec un septum, puis mis sous vide et rempli d’azote trois fois. Au flacon via une seringue, ont été ajoutés 30 ml de dichlorométhane anhydre (DCM) sous azote. Le flacon a été placé à température ambiante pendant une nuit. Le contenu du ballon a été concentré par évaporation rotative pour donner un produit brut qui a été soumis à une chromatographie sur gel de silice (CH2CL2/MeOH/CH3Dégradé par étapes COOH, 10:0:0→97:1,5:1,5→94:3:3). Les fractions contenant le produit souhaité ont été combinées et concentrées pour donner un solide jaune clair. Le produit a ensuite été purifié par lavage avec de l’eau désionisée 8 à 10 fois pour éliminer l’excès d’acide succinique et d’acide acétique, et séché par lyophilisation pour donner un solide pulvérulent blanc cassé. SGRH (EI) : calculé. pour C21H18Ô4N2, m/z le plus abondant = 362,1261 ; trouvé, 362.1270.
Le polyéthylène glycol a ensuite été couplé au ligand succinylé via un DIC (N,NProtocole de couplage médié par le ′-diisopropylcarbodiimide). Typiquement, dans un flacon Schlenk de 25 ml équipé d’un barreau d’agitation magnétique, on a ajouté le OH-PEG5k-OH (300 mg, 0,06 mmol), le ligand bispyridyle succinylé (87 mg, 0,24 mmol) et la 4-diméthylaminopyridine (8,0 mg, 0,065 mmol), le flacon a été bouché avec un septum et évacué et rempli d’azote trois fois. Au flacon via une seringue, ont été ajoutés 10 ml de dichlorométhane anhydre (DCM) et 2 ml de dichlorométhane anhydre (DCM). N,N-diméthylformamide (DMF) sous azote. Du DIC (80 µL, 0,52 mmol) a ensuite été ajouté sous azote. Le flacon a été placé à température ambiante pendant 48 h. Le produit brut a été purifié par prep-HPLC, le débit d’éluant était de 10 ml/min et la composition d’éluant était constituée de mélanges d’eau ultrapure et d’acétonitrile de qualité HPLC. Le gradient d’éluant consistait en une rampe linéaire de 35 % à 80 % d’acétonitrile pendant 0 à 30 min, suivie d’une rampe jusqu’à 95 % d’acétonitrile pendant 30 à 45 min. Les fractions contenant le produit ont été combinées, congelées et lyophilisées.
Préparation des échantillons sur cryo-grilles
L’échantillon d’apoferritine à chaîne lourde de souris a été exprimé et purifié selon le protocole standard.33.
Le bispyridyl PEG-5k (L-PEG-L) a été dissous à 50 mg/ml dans H2O et Pd (NON3)2 a été dissous à 5 mg/ml dans du DMSO comme solution mère. La solution mère a ensuite été diluée aux concentrations indiquées en utilisant le même tampon que les protéines avant de la mélanger à l’échantillon de protéines. Les grilles de carbone trouées ont été soumises à une décharge luminescente pendant 30 secondes avant l’application de tous les cryo-échantillons utilisés dans cette étude.
Pour la grille cryo-EM à particule unique, 1 μL d’apoferritine (2 mg/ml), 1 μL de L-PEG-L (6 mg/ml) et 1 μL de Pd(NO3)2 (0,72 mg/ml) ont été bien mélangés et appliqués sur des grilles de carbone trouées. Après 60 s d’incubation sur les grilles à 22 ° C sous 100% d’humanité, les grilles ont été tamponnées avec du papier filtre (TED PELLA 595) pendant 6 s et congelées par plongée dans de l’éthane liquide refroidi par de l’azote liquide à l’aide d’un Vitrobot FEI MarkIV. Pour préparer des cryo-grilles pour les études cryo-ET, un protocole similaire a été utilisé, sauf que les traceurs d’or (traceur BSA conventionnel, 10 nm, AURION) ont été mélangés à l’échantillon avant de les charger sur les grilles. Les grilles MSBP ont été préparées en remplaçant l’apoferritine par du tampon. Pour préparer la cryo-grille d’apoferritine sans MSBP, 3 μL d’apoferritine (0,67 mg/ml) ont été chargés sur les grilles de carbone trouées (Quantifoil 400 mesh Cu R1.2/1.3) qui ont été déchargées pendant 30 s. La grille a été gelée par plongée selon le même protocole.
La protéine recombinante du trimère HA achetée auprès de MyBioSource (numéro de catalogue MBS434205) a été dissoute dans un tampon PBS à la concentration indiquée. Pour préparer une grille de trimère HA uniquement pour les études cryo-EM à particules uniques, 3 μL de trimère HA (0,75 mg/ml) ont été appliqués sur une grille de carbone trouée (Quantifoil 400 mesh Au R1.2/1.3) qui a été déchargée luminescente pendant 30 s à 15 mA. Après 30 s d’incubation à 22 ° C sous 100% d’humanité, la grille a été tamponnée avec du papier filtre (TED PELLA 595) pendant 4 s et congelée par plongée dans de l’éthane liquide refroidi par de l’azote liquide. Pour préparer un trimère HA avec une grille MSBP pour les études cryo-EM à particules uniques, 3 μL de trimère HA (1 mg/ml), 0,5 μL de L-PEG-L (8 mg/ml) et 0,5 μL de Pd(NO3)2 (1 mg/ml) a été appliqué sur une grille de carbone trouée (Quantifoil 200 mesh Cu R2/2) qui a été déchargée luminescentement pendant 45 s à 15 mA. Après 120 s d’incubation à 22 ° C sous 100% d’humanité, la grille a été épongée avec du papier filtre (TED PELLA 595) pendant 7 s et congelée par plongée dans de l’éthane liquide refroidi par de l’azote liquide. Pour préparer une grille de trimère HA uniquement pour les études cryo-ET, 3 μL de trimère HA (0,75 mg/ml) ont été appliqués sur une grille de carbone trouée (Quantifoil 400 mesh Cu R1.2/1.3) qui a été déchargée par lueur pendant 30 s à 15 mA. Après 60 s d’incubation à 22 ° C sous 100% d’humanité, la grille a été tamponnée avec du papier filtre (TED PELLA 595) pendant 4 s et congelée par plongée dans de l’éthane liquide refroidi par de l’azote liquide. Pour préparer le trimère HA avec grille MSBP pour les études cryo-ET, un protocole similaire a été utilisé, à l’exception de 0,5 μL de L-PEG-L (4 mg/ml) et 0,5 μL de Pd(NO3)2 (0,5 mg/ml) ont été mélangés avec 3 μL de trimère HA (1 mg/ml) pour le chargement de la grille.
La catalase achetée auprès de Sigma (numéro de catalogue : C3556) a été appliquée sur une grille de carbone trouée (Quantifoil 400 mesh Cu R1.2/1.3) avec une concentration finale de 1 mg/ml. La β-galactosidase achetée chez Sigma (numéro de catalogue : 10105031001) a été dissoute à 3 mg/ml avec un tampon contenant 25 mM de Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl.2, 2 mM de β-mercaptoéthanol et appliqué sur une grille de carbone trouée (Quantifoil 400 mesh Cu R1.2/1.3). 3 μL de catalase ou de β-galactosidase ont été mélangés avec 0,5 μL de L-PEG-L (16 mg/ml) et 0,5 μL de Pd(NO3)2 (la concentration finale de MSBP est de 2 mg/ml) a été utilisée pour préparer un cryo-échantillon en suivant le même protocole que celui de l’hémagglutinine.
Collecte et traitement des données
Toutes les données cryo-EM ont été collectées avec un microscope électronique FEI Titan Krios G3i (Thermo Fisher Scientific) équipé d’un canon à émission de champ à haute luminosité fonctionnant à 300 kV.
Pour le cryo-EM à particule unique, les images ont été enregistrées avec un détecteur d’électrons direct K3 Summit (Gatan) utilisant l’EPU (Thermo Fisher Scientific) en mode comptage à un grossissement calibré de 81 000X (taille de pixel physique de 1,06 Å). La largeur de fente du Gatan Imaging Filter (GIF) Bio Quantum a été réglée à 20 eV. 2090 micrographies ont été collectées sur 8 s avec 7,13 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données sur l’apoferritine. 1587 micrographies ont été collectées sur 8 s avec 7,13 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données de l’apoferritine avec MSBP. 576 micrographies ont été collectées sur 5 s avec 10,35 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données du trimère HA. 3861 micrographies ont été collectées en 4,5 s avec 11,31 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données du trimère HA avec MSBP. 1053 micrographies ont été collectées en 4,5 s avec 11,24 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données de catalase. 1022 micrographies ont été collectées en 4,5 s avec 11,24 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données de catalase avec MSBP. 1317 micrographies ont été collectées en 4,5 s avec 11,24 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données de la β-galactosidase. 1278 micrographies ont été collectées en 4,5 s avec 11,25 e–/Oh2/s débit de dose pour l’ensemble de données de la β-galactosidase avec MSBP.
Toutes les micrographies de 40 images ont été collectées avec des valeurs de défocalisation allant de -2,5 μm à -1,3 μm (pour l’apoferritine et le trimère HA) ou de -2,5 μm à -1,0 μm (pour la catalase et la β-galactosidase).
La correction de la dérive des micrographies a été réalisée à l’aide de MotionCor234. Des sommes corrigées du mouvement sans pondération ont été utilisées pour l’estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) avec GCTF35. Des sommes corrigées du mouvement avec pondération des données ont été utilisées pour tous les autres traitements d’image. Particules captées par Gautomatch (https://www.mrclmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/) ont été extraits par RELION36 puis importé dans CryoSPARC37 pour un traitement ultérieur. Le modèle initial a été généré par reconstruction ab initio. Les particules bien triées par classification 2D itérative et raffinement hétérogène ont finalement été soumises à un raffinement homogène et non uniforme pour générer les cartes finales. Un affinement CTF a été effectué pour améliorer encore la résolution finale. Des informations détaillées sur le traitement des données sur l’apoferritine sont disponibles dans la Fig. 1 supplémentaire.
Des approches similaires ont été utilisées pour traiter l’ensemble de données du trimère HA (Fig. 13a supplémentaire), de la catalase (Fig. 2a, b supplémentaire) et de la β-galactosidase (Fig. 2c, d supplémentaires). Pour le trimère HA, des moyennes 2D ont été utilisées pour évaluer la distribution angulaire des particules. Les résultats finaux de la classification 2D pour le trimère HA avec ou sans MSBP peuvent être trouvés dans la Fig. 13d supplémentaire, e. Des modèles 2D de trimère HA avec MSBP générés par une carte de densité 3D ont été utilisés pour sélectionner davantage de particules dans les images en vue d’un traitement ultérieur afin de générer la carte finale. Des informations détaillées sur le traitement des données du trimère HA avec MSBP sont disponibles dans la figure supplémentaire 13a. Pour les ensembles de données de soustraction de catalase, la densité a été ajustée manuellement dans l’USCF-Chimera pour générer le masque pour le monomère, le dimère et le trimère. Les particules ont été soustraites dans cryoSPARC suivie d’un affinement local. Pour augmenter le nombre de particules des monomères, l’expansion de symétrie a été appliquée avec une symétrie D2 suivie d’une génération de masque, d’une soustraction et d’un raffinement local.
Pour les données cryo-ET de l’apoferritine, des séries d’inclinaisons de -60° à 60° avec des incréments de 3°, ont été collectées avec un détecteur d’électrons direct K3 Summit (Gatan) en utilisant la tomographie (Thermo Fisher Scientific) en mode comptage à un grossissement calibré de 42 000. X (taille de pixel physique de 2,09 Å). Une dose totale de 2,16 e–/Oh2 (pour l’apoferritine uniquement et le MSBP uniquement), 2,92 e–/Oh2 (pour l’apoferritine avec MSBP) et 2,72 e–/Oh2 (pour l’apoferritine avec PEG et l’apoferritine avec Pd(NO3)2) a été utilisé pour exposer chaque micrographie pendant environ 1 s (4 images par image) avec une défocalisation proche de -4 μm.
Pour les données cryo-ET du trimère HA, des séries d’inclinaisons de -45° à 45° avec des incréments de 3°, ont été collectées avec un détecteur d’électrons direct K3 Summit (Gatan) en utilisant la tomographie (Thermo Fisher Scientific) en mode comptage à un grossissement calibré de 53 000X (taille de pixel physique de 1,7 Å). Une dose totale de 4,19 e–/Oh2 (pour le trimère HA avec et sans MSBP) a été utilisé pour exposer chaque micrographie pendant environ 1,8 s (6 images par image) avec une défocalisation proche de -5 μm. Des approches similaires ont été appliquées pour le cryo-ET du complexe catalase, β-galactosidase, IMP1, IMP2 et CSW.
Les micrographies ont été alignées par MotionCor2 sans correction CTF. Les séries d’inclinaison ont été alignées sur la base de repères en or en créant manuellement un modèle de graine dans Etomo.38. Après la génération des tomogrammes, les particules ont été sélectionnées par correspondance de modèles dans Dynamo39.
Résumé du rapport
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport Nature Portfolio lié à cet article.
2024-01-09 15:05:05
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