Les métabolites microbiens intestinaux révèlent des changements métaboliques dépendants du régime alimentaire induits par l’administration de nicotine

Étude animale

Des souris mâles de type sauvage C57BL/6J (Japon SLC, Shizuoka, Japon) ont été hébergées dans une animalerie conventionnelle à 23,0 °C avec un cycle lumière-obscurité de 12 h. Avant de commencer les expériences, les souris ont été acclimatées aux conditions de laboratoire et nourries avec le régime CLEA Rodent Diet (CE-2, CLEA Japan, Tokyo, Japon). À l’âge de sept semaines, les souris mâles ayant un poids corporel moyen comparable ont été divisées en deux groupes : le groupe ND et le groupe HFD (D12492, 60 % de graisse kcal ; Research Diets, Inc., NJ, USA) et ont reçu des injections deux fois par jour de nicotine (0,75 mg/kg de poids corporel, administration intrapéritonéale) ou solution saline pendant quatre semaines¹⁵. Après l’intervention, les niveaux fécaux d’AGCC et de métabolites d’acides gras à longue chaîne ont été déterminés. Pour les expériences d’alimentation en couple, des souris mâles ont été élevées entre 7 et 11 semaines. Chaque cage abritait une souris de poids moyen similaire et leurs apports alimentaires respectifs ont été mesurés. Les souris témoins ont été nourries par paires pour correspondre à l’apport alimentaire des souris traitées à la nicotine. Dans ces conditions, les souris témoins ont reçu la quantité totale de nourriture consommée par les souris ayant reçu de la nicotine la veille, distribuées toutes les 12 heures le lendemain. Pour les expériences sur des modèles d’administration orale de nicotine, des souris mâles âgées de 7 semaines ont reçu une solution de nicotine (200 μg/mL dans un véhicule de saccharine à 2 %) dans de l’eau potable, comme indiqué précédemment.³³, pendant la période de quatre semaines d’exposition au HFD. Pour le traitement antibiotique, les souris nourries avec HFD ont été traitées avec de l’ampicilline (0,4 mg/mL, FUJIFILM Wako, Osaka, Japon), de la néomycine (0,4 mg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), du métronidazole (0,4 mg/mL, FUJIFILM Wako) et de la vancomycine (0,2 mg/mL, FUJIFILM Wako) dans l’eau potable pendant quatre semaines. Au cours des expériences, le poids corporel a été mesuré une fois par semaine. Dans tous les modèles animaux expérimentaux, les souris ont été disséquées après 5 heures de jeûne. Des échantillons de sang ont été prélevés de la veine cave inférieure à l’aide de tubes traités à l’héparine. Les tubes ont été immédiatement centrifugés à 7000g pendant 5 min à 4 °C pour séparer le plasma. Après administration de nicotine, le cerveau, la rate, les reins, le foie, le WAT et le tractus gastro-intestinal ont été prélevés et leurs poids ont été comparés.

Analyses biochimiques du plasma

Les concentrations de glycémie ont été évaluées à l’aide d’un appareil One Touch Ultra de LifeScan (Milpitas, CA, USA). Les taux plasmatiques de cholestérol total, de NEFA et de TG ont été mesurés à l’aide de kits disponibles dans le commerce (LabAssay Cholesterol pour le cholestérol total, LabAssay NEFA pour les NEFA et LabAssay Triglyceride pour les TG ; FUJIFILM Wako), en suivant un protocole décrit précédemment.³⁴.

Quantification des métabolites microbiens intestinaux par chromatographe liquide-spectrométrie de masse (LC-MS/MS)

Les métabolites microbiens intestinaux des LCFA utilisés dans cette étude ont été synthétisés selon des méthodes précédemment publiées avec une pureté minimale de 98 %⁵. Pour mesurer les métabolites individuels dérivés des acides gras, environ 50 mg de contenu fécal ont été homogénéisés dans 1 ml de méthanol et un contrôle interne (C19 : 0) a été ajouté aux échantillons. Ensuite, 2 ml de chloroforme et 0,75 ml de chlorure de potassium 0,5 M ont été ajoutés pour extraire les lipides. Les couches lipidiques ont été collectées, séchées et reconstituées dans un mélange de chloroforme et de méthanol (1:3, v/v) pour analyse LC-MS/MS. Les métabolites dérivés des acides gras ont été analysés à l’aide d’un système Acquity UPLC couplé à une spectrométrie de masse Waters Xevo TQD (Waters, Tokyo, Japon) équipée d’une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 × 150 mm, 1,7 μm ; Waters). Les paramètres de surveillance de réactions multiples ont été optimisés pour chaque composé cible à l’aide de normes. La quantification a été réalisée à l’aide de courbes d’étalonnage spécifiques à chaque composé et les récupérations ont été surveillées à l’aide d’étalons internes deutériés.

Mesure des SCFA par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC/MS)

Les SCFA fécaux ont été déterminés à l’aide d’une procédure modifiée, comme décrit précédemment³⁵. Les couches d’éther contenant des SCFA ont été combinées et soumises à une analyse GC – MS à l’aide d’un instrument GCMS-QP2010 Ultra (Simadzu, Kyoto, Japon). La concentration de SCFA dans chaque échantillon a été quantifiée en utilisant un étalonnage standard externe sur une plage de concentrations définie.

Analyse du microbiote intestinal par séquençage du gène ARNr 16S

L’ADN fécal a été extrait d’échantillons congelés à l’aide du kit FastDNA® SPIN pour les matières fécales (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). La région V4 du gène de l’ARNr 16S a été amplifiée à l’aide d’amorces à double index. Le séquençage des amplicons a été réalisé sur un instrument Illumina MiSeq avec un kit de réactifs MiSeq V3 (Illumina, San Diego, CA, USA), selon les protocoles établis.³⁶. Le traitement de lecture et le filtrage de qualité ont été effectués à l’aide de la version 1.9.1 de Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME). et aligné sur la base de données SILVA (http://www.arb-silva.de) au niveau Non classé. Une analyse plus approfondie à chaque niveau taxonomique impliquait la normalisation des données, et l’identification de taxons différentiellement abondants était basée sur le critère d’une valeur p ajustée en fonction du taux de fausse découverte (FDR) <0, 05, en utilisant la procédure Benjamini – Hochberg. Les tracés PCA et l'analyse de clustering basée sur une carte thermique ont été réalisés à l'aide respectivement des fonctions prcomp et heatmap du package R. Ces analyses visaient à détecter et visualiser des modèles de regroupement à chaque niveau taxonomique.

analyses statistiques

Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne. GraphPad Prism version 8.1.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) a été utilisée pour les analyses statistiques. La normalité des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro-Wilk. Pour les comparaisons statistiques, le test t de Student (bilatéral) ou le test U de Mann – Whitney (bilatéral), ou l’analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivi du test de Tukey ou du test de Kruskal – Wallis suivi de Le test post-hoc de Dunn ou l’ANOVA bidirectionnelle avec le test de Bonferroni ont été appliqués selon le cas, en fonction de la normalité des données. La signification statistique a été fixée à P.< 0,05. Une analyse multivariée permutationnelle des tests de variance a été réalisée pour évaluer la similarité des microbiomes. Les valeurs q du FDR dans le séquençage de l'ADNr 16S ont été estimées à l'aide de la procédure Benjamini – Hochberg.

Approbation éthique

Toutes les procédures associées aux souris ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés du comité d’expérimentation animale de l’université de Kyoto (Lif-K22015) et de l’université d’agriculture et de technologie de Tokyo (permis n° 28-87) pour le traitement éthique des animaux. Toutes les méthodes ont été approuvées par le Comité d’expérimentation animale de l’Université de Kyoto (Lif-K22015) et l’Université d’agriculture et de technologie de Tokyo (Permis n° 28-87). Les souris ont été euthanasiées sous anesthésie profonde à l’isoflurane, et tous les efforts ont été déployés pour minimiser tout inconfort ou souffrance potentiel ressenti par les animaux. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org).