Population étudiée
Tous les donneurs et patients étaient d’origine chinoise. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants. Neuf échantillons de sang déficients en CD36 de type I et treize échantillons de sang déficients en CD36 de type II provenant de donneurs de sang en bonne santé, comprenant 76,19 % d’hommes et 23,81 % de femmes, âgés en moyenne de 34,19 ± 7,13 ans (extrêmes : 18 à 55 ans), ont été randomisés. collectés auprès de la banque de déficit en CD36 du Guangzhou Blood Center. Sept échantillons de sang normaux provenant de donneurs de sang en bonne santé (71,43 % d’hommes et 28,57 % de femmes avec un âge moyen de 35,57 ± 7,51 ans, entre 18 et 55 ans) ont également été collectés au hasard au Guangzhou Blood Center. Quatre échantillons de sang de patients présentant un déficit en CD36 de type I ont été prélevés au hasard chez des patients FNAIT ou PTR présentant des anticorps anti-CD36 entre 2015 et 2022 au service de tests cliniques du Guangzhou Blood Center (Tableau 1)8,18,19. Les échantillons ont été recherchés à la recherche d’anticorps contre les érythrocytes à l’aide du test de Coombs et tous les résultats ont été négatifs.
Tableau 1 Cas FNAIT et PTR associés aux anticorps anti-CD36.
Conception d’amorces, amplification, préparation de bibliothèques et séquençage SMRT
Le panel d’amorces a été conçu pour amplifier les régions allant de 5′ UTR à 3′ UTR des gènes CD36. Des séquences de régions introniques ont également été incluses. Sept ensembles d’amorces ont été conçus pour amplifier les amplicons avec un chevauchement de plus de 1 kb entre chaque amplicon, et tous les amplicons sont répertoriés sur la figure 1. Toutes les amorces utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le matériel supplémentaire 1. Réaction en chaîne par polymérase à longue portée ( LR-PCR) a été réalisée avec l’ADN polymérase KOD FX Neo (TOYOBO) conformément aux instructions du fabricant, en utilisant des conditions de cycle de PCR consistant en un cycle en deux étapes de 10 minutes chacune pendant 30 cycles. Les produits de PCR ont été détectés par électrophorèse sur gel d’agarose, puis purifiés avec des billes 0,6 × Ampure PB (Pacific Biosciences).
Figure 1
Structure génétique du locus du gène CD36. Cela délimite la structure exon-intron du gène CD36 humain, avec les emplacements des amplicons PCR à lecture longue et les emplacements exoniques. Les régions non traduites sont en rouge et les séquences codantes en bleu.
Les bibliothèques SMRT (Single-Molecule Real-Time) ont été préparées à l’aide d’une méthode en une étape conformément aux instructions du fabricant. Dans cette méthode, la réparation des dommages à l’ADN, la réparation des extrémités et la ligature des adaptateurs ont été effectuées simultanément pour produire des bibliothèques de pré-séquençage contenant des adaptateurs de codes-barres uniques. La bibliothèque finale a été recuite avec des enzymes de séquençage et des amorces à l’aide du kit de liaison Sequel II 2.2 (Pacific Biosciences) et du kit de contrôle interne ADN 1.0 (Pacific Biosciences). Ensuite, des complexes d’ADN polymérase de 150 pM ont été chargés et séquencés à l’aide de la plateforme Sequel II (Pacific Biosciences) avec une durée d’exécution de 20 heures.
Analyse des données, appel de variantes d’ADN et mise en phase des haplotypes
Le logiciel SMRT Link (v10.1.0, Pacific Biosciences) a été principalement utilisé pour analyser les données de sortie. Les lectures brutes ont d’abord été démultiplexées et codées automatiquement à la fin des analyses de séquençage, puis les sous-lectures ont été analysées pour générer des lectures CCS à l’aide du logiciel ccs v.3.0.0 (https://github.com/pacificbiosciences/unanimity/). Les lectures filtrées du CCS ont été alignées sur le génome humain de référence (GRCh38) à l’aide de pbmm2 (https://github.com/PacificBiosciences/pbmm2). Les lectures CCS cibles ont été réalignées sur le génome de référence (GRCh38) à l’aide de pbmm2. L’appel de variantes a été effectué avec Google DeepVariant (v1.2.0) pour identifier les SNV et les petits indels. Enfin, les séquences de contig d’amplicons ont été progressivement transformées en haplotypes individuels à l’aide de l’assembleur Flye. Enfin, les données de sortie ont été compilées et des haplotypes individuels, y compris des haplotypes de régions de croisement de gènes, ont été générés à l’aide d’un module sciprt interne.
Analyse du déséquilibre de liaison du CD36, construction d’arbres phylogénétiques et analyse d’association de variantes
Pour visualiser le déséquilibre de liaison par paire entre les variantes génétiques et identifier les groupes de liaison au sein de CD36, nous avons généré des cartes thermiques LD à l’aide de LDBlockShow (v1.40) avec des fréquences alléliques mineures.
Dosage de la luciférase
FNAIT 1
À 23 semaines de gestation, un fœtus chinois a reçu un diagnostic d’hydrops fetalis (HF) par échographie. Une augmentation de la vitesse systolique maximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA-PSV) à 58 cm/s a été détectée chez le fœtus. Sa mère, âgée de 29 ans (Luo, le numéro est 23N00901, Matériel supplémentaire 2) sans antécédents de transfusion sanguine ou de transplantation, avait connu trois fausses couches dues à une mort fœtale intra-utérine (DIU) ou à une hydrops fetalis (HF). Des tests d’antiglobuline directs et indirects ont été utilisés pour rechercher des anticorps irréguliers contre les érythrocytes dans le sérum maternel. Les résultats des analyses ciblées des variantes pathogènes des gènes de la thalassémie (HBA1, HBA2, HBB) étaient également négatifs. Le séquençage à lecture longue du gène CD36 maternel révèle que ses deux allèles portaient des SNV ou in/dels non-sens (c.329_330delAC sur un allèle et c.1006 + 2 T > G sur l’autre). Les deux allèles portaient également la mutation c.-132 A > C dans le 5′-UTR. L’analyse FACS de l’expression de l’antigène de surface CD36 sur les plaquettes et les monocytes a révélé un déficit en CD36 de type I chez ce patient (Tableau 2).
Tableau 2 Caractéristiques cliniques avant et après deux interventions intra-utérines chez deux patientes FNAIT avec l’haplotype c.-132 Cc.329_330delAC.
FNAIT2
La mère de 27 ans, atteinte d’un déficit en CD36 de type I, n’avait aucun antécédent de transfusion sanguine ni de greffe et a fait une fausse couche détectée par échographie à 23 semaines de gestation en raison d’une insuffisance cardiaque. La vitesse systolique maximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA-PSV) à 22 semaines de gestation au cours de la deuxième grossesse était de 60 cm/sec. Les résultats du test d’antiglobuline direct et indirect étaient négatifs pour la présence d’anticorps anormaux contre les globules rouges dans le sérum maternel. Les résultats des tests d’analyse ciblée des variantes pathogènes des gènes de la thalassémie (HBA1, HBA2 et HBB) étaient également négatifs. Chaque allèle de son gène CD36 portait un SNVs ou in/dels non-sens (c.329_330delAC sur l’un et c.430-1G > C sur l’autre). Les deux allèles portaient également la mutation c.-132 A > C. Des anticorps anti-CD36 ont été détectés dans le sérum sanguin fœtal et maternel (Tableau 2). La patiente a donné naissance à une petite fille prématurée à 32 semaines de gestation.
Analyse par cytométrie en flux d’anticorps anti-CD36 provenant de sérum fœtal à l’aide de cellules HEK293T transfectées
Figure 2
Déséquilibre de liaison par paire entre les variantes et les groupes de liaison dans CD36 avec des modèles LD. La région d’environ 35 kb du gène CD36, s’étendant de la 5′ UTR à la 3′ UTR, est divisée en bloc 5′ (partie avant) et en bloc 3′ (partie queue). Ces blocs sont séparés par un point d’arrêt autour de l’intron 3 à l’intron 4. Les points ci-dessus indiquent le test exact de Fisher entre les variantes génétiques et les phénotypes observés (Type I/II ou sain). Une association plus forte a été trouvée entre les variantes du bloc 5′ et le déficit de type I.
Approbation éthique et consentement à participer
Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets inscrits et le protocole a été approuvé par le comité d’éthique du Guangzhou Blood Center (approbation éthique n° GZBC-2022-052). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur.
#Lanalyse #des #haplotypes #révèle #base #génétique #déficit #CD36 #type
