Médicaments et réactifs
Le bromhydrate de 6-OHDA et le chlorhydrate d’apomorphine ont été achetés chez Sigma-Aldrich, USA. L’anticorps contre Alox15 a été acheté chez Abcam, USA. Les anticorps contre le TH, la β-actine et le GAPDH ont été achetés auprès de Proteintech, Chine. Les anticorps de chèvre anti-lapin/souris provenaient de CWBiotech, Chine. Trizol provenait d’Invitrogen Life Technologies, États-Unis. Le kit de préparation de bibliothèque d’ARN directionnel NEBNext® Ultra ™ pour Illumina® a été acheté auprès de NEB, États-Unis. Le kit de test d’acide urique (UA) a été acheté auprès de Biosino Biotechnolgy and Science Inc., Chine. Le kit de test immuno-enzymatique (ELISA) pour DA a été acheté auprès de Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Chine. Des kits ELISA pour la 5-hydroxytryptamine (5-HT) et le NfL ont été achetés auprès de CUSABIO, Chine. Le kit ELISA pour le Gamma-aminobutyrique (GABA) était ImmuSmol, France. HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR et le master mix 2X Taq Pro Universal SYBR qPCR ont été achetés auprès de Vazyme Biotech, Chine.
Animaux expérimentaux
Des rats mâles Sprague-Dawley (190-210 g, certificat n° SCXK (Jing) 2016-0011) ont été fournis par Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Dans un environnement SPF avec un cycle lumière-obscurité 12/12 ( 22 à 25 °C, 60 à 70 % d’humidité), les animaux avaient libre accès à l’eau et à la nourriture. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Et les protocoles ont été approuvés par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de matière médicale de l’Académie chinoise des sciences médicales.
Sélection des patients
Au total, 17 patients présentant un diagnostic clinique de MP ont été évalués à la clinique des troubles du mouvement de l’hôpital Tiantan de Pékin, de la Capital Medical University. Des témoins sains (HC) ont été sélectionnés parmi les soignants des patients. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital Tiantan de Pékin, Capital Medical University. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les volontaires. Au départ, un examen neurologique standardisé a été réalisé, comprenant l’échelle d’évaluation unifiée de la maladie de Parkinson de la Movement Disorder Society (MDS-UPDRS)46 et l’évaluation du stade Hoehn et Yahr (H&Y).47
Classification des patients atteints de MP en sous-types Mix, TD et PIGD
Chirurgie
Administration de baicaléine
Des études antérieures ont montré que la baicaléine à des doses de 100, 200 et 400 mg/kg pouvait supprimer de manière significative les tremblements chez les rats PD. Ainsi, 200 mg/kg ont été déterminés comme dose pour examiner l’effet de la baicaléine chez différents sous-types de rats PD. Après le sous-typage, les rats de chaque sous-type ont été répartis au hasard en 3 groupes : modèles (CMC-Na ig), baicaléine (200 mg/kg/j ig) et madopar (50 mg/kg/j ig). Tous les rats ont été traités comme décrit pendant 4 semaines.
Test de comportement en rotation
Après administration d’apomorphine (0,5 mg/kg, sc), les rats ont été placés dans des récipients individuels transparents d’un diamètre de 40 cm. Après que les rats se soient habitués à l’environnement pendant 10 min, la fréquence des rats effectuant des virages à 360° dans le sens controlatéral de la lésion en 30 min a été comptée.
Test de la tige rotative
Les performances motrices de rats induits par la 6-OHDA sur une tige mobile ont été mesurées par le système Rotarod DXP-3 (Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences et Peking Union Medical College, Pékin, Chine).25 Le rat a été placé sur la tige en rotation à une vitesse de rotation de 6 s/rpm, le temps a été compté jusqu’à ce qu’elle tombe de la tige en 120 s, ce qui a été exprimé en temps de latence. Avant l’opération, les rats ont été traités pour apprendre à courir sur la tige rotative pendant 3 jours.
Essai en champ ouvert
L’activité locomotrice spontanée des rats a été mesurée par le test en champ ouvert. Les rats ont été placés pendant 5 min dans le carré central d’une boîte (50 cm × 50 cm × 50 cm) dont le fond était divisé en 25 carrés égaux.49 Le nombre de carrés traversés a été compté par le logiciel SuperMaze (Shanghai XinRuan Information Technology Co. , Ltd, Shanghai, Chine). L’appareil en champ ouvert a été nettoyé avant chaque test.
Test de fonction neurologique
La fonction neurologique des rats a été testée par un chercheur sans aucune connaissance préalable, c’est-à-dire en aveugle, des conditions de répartition des groupes. Sur la base des caractéristiques comportementales des rats induits par la 6-OHDA, les plaies de Longa et les scores de gravité neurologique (NSS) ont été modifiés. Hors réflexes, fonctions neurologiques, notamment motrices (4 points), sensorielles (2 points) et équilibre (6 points), les scores ont été notés sur une échelle numérique de 0 à 12,50, les scores plus élevés indiquant une plus grande gravité.
Enregistrement électromyographique
Les tremblements chez les rats induits par la 6-OHDA ont été enregistrés par BL-420S (Tme, Chengdu, Chine).24 Les doubles électrodes d’enregistrement ont été insérées dans le muscle fessier des rats et l’électrode de référence a été mise à la terre. Le collecteur de bioinformations BL-420S a été utilisé pour détecter les signaux d’électromyographie (EMG) sur la patte arrière de rats éveillés. Le signal de stimulation était de 1 mV, la plage était de 1 mV, le filtrage passe-haut était de 0,001 s et le filtrage passe-bas était de 10 kHz.
Coloration immunohistochimique
Les rats ont reçu une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde à 4 %. Les cerveaux ont été immédiatement isolés. Une fois les tissus inclus en paraffine bloqués par le sérum, ils ont été incubés avec les anticorps primaires (TH et α-syn) pendant une nuit à 4 ° C et les anticorps secondaires à 25 ° C pendant 2 h. Ensuite, les coupes immunohistochimiques ont été co-incubées avec du peroxyde de 3,3′-diami-nobenzidine (DAB) et contre-colorées à l’hématoxyline. Et les coupes d’immunofluorescence ont été incubées avec une solution de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 minutes à température ambiante. Nico Eclipse Ti-SR (Nikon, Tokyo, Japon) a été utilisé pour capturer les images. Le nombre moyen de cellules positives quantifiées par Image-Pro Plus 6.0 a été utilisé pour représenter la densité cellulaire.
Analyse du transcriptome des DEG
Étant donné que les résultats de la coloration immunohistochimique TH ont montré différents degrés de dommages aux neurones dopaminergiques du SN chez différents sous-types de rats PD, l’ARN total du SN a été extrait à l’aide du réactif Trizol (Invitrogen Life Technologies). La concentration, la qualité et l’intégrité ont été déterminées par un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Scientific). La bibliothèque d’ADNc a été établie par le kit de préparation de bibliothèque d’ARN directionnel NEBNext® Ultra™ pour Illumina®. Une fois les bibliothèques d’ADNc purifiées (système AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, FL, USA) et quantifiées (système Bioanalyzer 2100, Agilent, Palo Alto, CA, USA), l’ADNc a été séquencé sur une plateforme NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis). Les fichiers de référence sur le génome et les annotations de gènes ont été téléchargés à partir du site Web du génome. Les lectures filtrées ont été mappées sur le génome de référence à l’aide de HISAT2 v2.0.5. Le logiciel DESeq2 a été utilisé pour évaluer les DEG dans les conditions de sélection suivantes : différence d’expression multiple |log2FoldChange | > 1, valeur p significative ≤ 0,05.
Analyse LC-MS des profils de métabolites
Compte tenu de la facilité de disponibilité d’échantillons de sérum clinique, du sérum de rat a également été sélectionné pour les expériences suivantes. L’analyse métabolomique a été sélectionnée chez les rats et les patients du groupe témoin (n = 6), du groupe Mix (n = 6), du groupe TD (n = 5-6) et du groupe PIGD (n = 6). Le sérum a été extrait à raison de 100 μL pour 500 μL de méthanol. Après centrifugation à 4 °C (14 000 tr/min, 20 min), le surnageant de chaque échantillon a été examiné. Les spectres 1H-RMN d’un spectromètre RMN Bruker Avance III 600 MHz ont été utilisés avec le logiciel MestReNova (Mestrelab Research, Saint-Jacques-de-Compostelle, Espagne) pour obtenir la transformée de Fourier. Ensuite, les pics de signal dans les spectres ont été adaptés à des métabolites spécifiques à l’aide de la littérature documentée ainsi que de la base de données RMN. Enfin, les différents métabolites ont été examinés pour étudier les voies métaboliques par MetaboAnalyst 5.0.
Dosage du contenu en NfL, UA et neurotransmetteurs
La teneur en UA a été détectée par l’analyseur biochimique automatique (Toshiba Accute TBA-40FR, Toshiba Corporation, Tokyo, Japon) conformément aux instructions du fabricant. À l’aide d’un lecteur de microplaques, la teneur en neurotransmetteurs (5-HT, DA, GABA) dans le SN lésé et la teneur en NfL dans le sérum ont été détectées conformément aux directives du kit ELISA du fabricant.
PCR quantitative en temps réel
Western blot
Les tissus cérébraux de rat ont été lysés selon le protocole en utilisant le tampon RIPA. Des quantités égales de protéines totales ont été séparées par SDS-PAGE à 12 % et transférées sur des membranes PVDF. Après blocage avec 5 % de lait écrémé dans du TBST, les membranes ont été lavées et incubées avec des anticorps. Enfin, les bandes ont été visualisées par le système d’imagerie Tanon 4600 (Tanon Technology Co., Ltd, Pékin, Chine) de super ECL (Applygen Technologies Inc. Pékin, Chine).
Analyse statistique
Les données expérimentales quantitatives ont été calculées sous forme de moyenne ± écart type (SEM), représentatives d’au moins trois expériences indépendantes. Les différences entre le groupe témoin et les sous-types de groupes PD ont été déterminées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle, et la différence entre les deux groupes de sous-types a été testée par l’analyse de Student. t-test. P.
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