Cellules et animaux
Les cellules souches mésenchymateuses surnageant et le plasma sanguin de cordon ont été fournies par Henan Yinfeng Bioengineering Technology Co., Ltd. Les cellules HDF-A ont été achetées auprès d’OTWO Biotech. MICE BALB / C mâle de qualité SPF âgée de 6 à 8 semaines (26 à 30 g) achetée auprès de la Biotechnology de Changsheng Biotechnology, Ltd.
Isolement et purification de MSC-EVS et UCB-EVS
Culture cellulaire Supernatant19 ou plasma20 dilué 1: 1 avec du PBS a été centrifugé à basse vitesse (4 ° C, 2000 × g, 30 min; 4 ° C, 10 000 × g, 45 min). Les suspensions ont été filtrées à travers un filtre de débattage de 0,22 μm. L’Ultracentrifugation (Beckman) a été réalisée deux fois plus (4 ° C, 110 000 × g, 70 min). Le surnageant a été jeté et le précipité a été remis en suspension dans un PBS de 1,5 à 2 ml, transféré dans un tube EP de 2 ml et conservé à -80 ° C.
Identification de MSC-EVS et UCB-EVS
Le processus Western blot (WB) était le suivant16: les tampons de chargement des protéines et 5 x SDS ont été mélangés à un rapport 4: 1, et la protéine a été dénaturée (99 ° C, 10 min). Un gel à 10% a été préparé pour l’électrophorèse. Une fois l’achèvement, le transfert de membrane PVDF (Millipore) a été effectué. La membrane a été bloquée avec 5% de BSA à température ambiante pendant 2 h. Les anticorps primaires (souris anti-CD63 (ABCAM), souris anti-TSG101 (ABCAM)) ont été incubés à 4 ° C pendant 12 à 16 h. La membrane a été lavée et incubée avec un anticorps secondaire (mouton anti-souris (Proteintech)) pendant 2 h. L’expression de CD63 et TSG101 a été mesurée à l’aide d’un système d’imagerie GE.
Traçage de fluorescence de MSC-EVS et UCB-EVS
Un total de 3 × 104 cellules HDF-A par puits ont été préparés dans une plaque à 24 puits. Les EV ont été mélangés avec du PBS et du colorant fluorescent PKH67 (Sigma-Aldrich) dans un rapport 25: 250: 1 et incubé à 37 ° C pendant 5 min. Un millilitre de PBS contenant 0,5% de BSA a été ajouté pour mettre fin à la réaction d’étiquetage. Les véhicules électriques marqués ont été réenractés par ultracentrifugation (120 000 x g, 4 ° C, 60 min) et remis en suspension dans du PBS. Des véhicules électriques marqués à 80 µg / ml ont été ajoutés à des plaques à 24 puits et cultivés pendant 24 h, suivis d’une fixation avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min. La coloration DAPI (Sigma-Aldrich) a été effectuée pour 1 H21. Les cellules ont été couvertes sur une diapositive avec un extincteur anti-fluorescence et observées au microscope à fluorescence (Leica).
Culture de HDF-A
Les cellules HDF-A ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (Corning) contenant 10% de FBS (37 ° C, 5% de CO2). Lorsque les cellules étaient confluentes à 90%, le surnageant a été jeté et les cellules ont été lavées 1 à 2 fois avec du D-PBS (Corning). Par la suite, 1 ml d’enzyme pancréatique EDTA à 0,25% (Corning) a été ajouté et digéré à 37 ° C pendant 2 min. La digestion a été terminée avec 1 ml de milieu RPMI-1640 contenant 10% de FBS (Oricell) et centrifugé à 1000 tr / min pendant 4 min. Les cellules ont été inoculées dans une boîte de culture et placées dans un incubateur (Sanyo) (37 ° C, 5% de CO2) pour une culture supplémentaire.
Test de grattage cellulaire
Une ligne droite a été tracée à l’arrière de chaque puits dans une plaque à six puits à des intervalles de 1 cm. Un total de 5 × 105 cellules HDF-A ont été ajoutés à chaque puits (n= 3). Une fois que les cellules ont atteint la confluence, des rayures ont été fabriquées avec une pointe de pipette de 200 µl perpendiculaire au puits et à la ligne. Les puits ont ensuite été lavés avec du D-PBS et un milieu sans sérum a été ajouté. Trois groupes ont été établis: témoin (100 µL / ml de D-PBS), MSC-EVS (100 µg / ml) et UCB-EVS (100 µg / ml). Les plaques ont été cultivées à 37 ° C dans un incubateur de CO2 à 5% pour 0, 12 et 24 h. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour mesurer la zone et la largeur moyenne des rayures pour calculer le taux de migration. La zone fermée de la rayure a été calculée comme suit: zone de migration (%) = (A0-AN) / A0 × 100, où A0 est la zone de rayure initiale et An est la zone restante.
Test de migration cellulaire
Dans un milieu à faible sérum (1% FBS) avec ou sans MSC-EVS (100 µg / ml) et UCB-EVS (100 µg / ml), 1 × 104 HDF-A cellules par puits (n= 3) ont été inoculés dans la chambre supérieure d’une plaque à 24 puits contenant un filtre à pores de 8 µm. Un milieu de culture complet sans EV (contenant 10% de FBS) a été ajouté à la chambre inférieure. Après 24 h, les cellules attachées à la surface supérieure du filtre ont été retirées. Les cellules HDF-A migrées ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 30 min et colorées avec 0,5% de cristal violet pendant 30 min. Le nombre de cellules migrées a été observée au microscope optique.
Test de prolifération cellulaire (CCK-8)
Un total de 5 × 103 cellules HDF-A par puits (n= 6) ont été inoculées dans des plaques à 96 puits et cultivées dans un milieu contenant MSC-EVS et UCB-EVS à différentes concentrations (80, 100, 120 µg / ml). Un groupe sans cellule a servi de contrôle vide. À 12, 24, 48 et 72 h, une solution CCK-8 (Solarbio) (10 µl) a été ajoutée à chaque puits et incubée à 37 ° C pendant 3 h. L’absorbance a été mesurée à 450 nm en utilisant un instrument marqué enzymatique (Billerica). La viabilité cellulaire a été calculée comme suit:
(: text {c} text {e} text {l} text {l} : text {v} text {i} text {a} text {b} text {i } text {l} text {i} text {t} text {y} = frac { text {d} text {o} text {s} text {i} text {n} texte {g} : text {g} text {r} text {o} text {u} text {p} : text {o} text {d} – text {b} text {l} text {a} text {n} text {k} : text {g} text {r} text {o} text {u} text {p} : Texte {O} Texte {D}} { Text {C} Text {O} Text {n} Text {T} Text {R} Text {O} Text {L} : Text {g} text {r} text {o} text {u} text {p} : text {o} text {d} – text {b} text {l} text {a } text {n} text {k} : text {g} text {r} text {o} text {u} text {p} : text {o} text {d} } ) × 100%
PCR quantitative en temps réel (QRT-PCR)
Tableau 1 Séquence d’amorces d’ARNm pour qRT-PCR.
Modèle et traitement des plaies de la peau de souris
Un modèle de plaie cutanée a été établi chez des souris BALB / C mâles de qualité SPF âgées de 6 à 8 semaines (26 à 30 g). Le dos de chaque souris a été rasé et ciré. Après 4 à 5 h, les souris ont été amenées à terminer l’anesthésie avec 2-2,5% d’isoflurane et maintenu avec 1-1,5% d’isoflurane pour créer une plaie cutanée complète (10 mm de diamètre) 20,22. Quarante-cinq souris ont été divisées au hasard en 3 groupes de traitement (n= 15). À partir du jour 3, MSC-EVS, UCB-EVS ou PBS ont été injectés par voie sous-cutanée autour de la plaie pendant 5 jours consécutifs (40 µg d’EVS dilués dans 200 µl de PBS par jour). Les blessures ont été photographiées pendant le processus de guérison. Toutes les blessures ont été mesurées à l’aide d’étriers, et l’aire de chaque blessure a été évaluée à l’aide du logiciel Image Pro Plus 6 les jours 3, 7, 11, 15 et 17. Le taux de cicatrisation des plaies a été calculé comme (%) = (A0-AT) / A0 × 100, où A0 est la zone initiale de la plaie et AT est la zone de la blessure aux jours postopératoires 3, 7, 11, 15 et 17. de chaque groupe de traitement. Cette enquête a été menée conforme aux critères d’arrivée pour la déclaration de la recherche impliquant des animaux, garantissant une documentation complète de la conception expérimentale, des techniques et des résultats. Le comité de recherche animale de l’Université agricole du Henan a accordé l’approbation du protocole expérimental. (Réf. No.: HNND2024092901). Notamment, toutes les procédures impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives et réglementations pertinentes, garantissant le respect des normes éthiques pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire.
Analyse histopathologique
Des échantillons de peau de chaque groupe de traitement ont été prélevés et immédiatement placés dans des tubes à centrifugeuse de 50 ml contenant 4% de paraformaldéhyde (biosharp) pour la fixation. Après rinçage et déshydratant avec une série de différentes concentrations d’alcool, les échantillons ont été intégrés dans la paraffine. La coloration a été effectuée pour observer les changements histologiques, le nouvel épiderme, le derme, les follicules pileux régénérés et les adipocytes au microscope optique. La largeur de cicatrice a été mesurée et le pourcentage de nouveaux épithélium a été évalué 14. Le pourcentage de réépithélialisation (E%) a été calculé comme: E% = (wn / wo) × 100, où WO est la zone de la plaie d’origine et Wn est la longueur des cellules épithéliales nouvellement formées à travers la surface de la plaie. La coloration du trichrome de Masson a été réalisée et des photographies ont été prises au microscope optique pour observer le degré de maturité du collagène et l’état des fibres ondulées dans la plaie.
Analyse ST
L’échantillon a été traité comme suit: des échantillons de peau (6,5 × 6,5 mm², épaisseur> 3 mm) ont été prélevés sur des souris dans différents groupes de traitement au jour 17. L’agent d’intégration de l’OCT (Sakura) a été pré-refroidi sur de la glace écrasée pendant 30 min, et Un moule d’incorporation de taille appropriée a été sélectionné pour intégrer le tissu cutané. Sectes congelées. (5–10 μm) ont été préparés à -20 ° C. Les échantillons fixes ont été colorés avec lui et photographiés pour déterminer les informations histologiques.
Le tissu a été perméabilisé, l’ARNm intracellulaire a été libéré et une sonde avec des informations spatiales de code-barres a été liée. L’ADNc a été synthétisé sur la diapositive, les échantillons ont été digérés, la sonde a été récupérée et l’ADNc a été amplifié. La bibliothèque a été construite et séquencée à l’aide d’un instrument de séquençage à haut débit Illumina pour obtenir des données de séquençage.
Analyse statistique
Tous les tests ont été effectués avec au moins 3 répétitions par groupe, et les tests in vitro ont été répétés au moins 3 fois. Les données de chaque groupe de tests ont été exprimées en moyenne ± écart-type (SD). Les moyennes entre plusieurs groupes ont été comparées en utilisant une analyse de variance unidirectionnelle. Des comparaisons de moyennes entre deux groupes ont été effectuées en utilisant des tests t d’échantillons indépendants. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism. La signification statistique a été définie comme *PP p
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