2024-06-28 14:41:54
Les auteurs rapportant des expériences sur l’utilisation d’échantillons humains et/ou de tissus humains ont tous été menés conformément aux directives et réglementations en vigueur. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets et/ou tuteurs légaux. L’étude a été menée conformément aux directives et réglementations en vigueur pour toutes les méthodes.
Participants
Dans notre hôpital, nous avons réalisé une étude de cohorte prospective du 21 juin 2020 au 30 septembre 2023, auprès de patients potentiellement atteints du COVID-19, à l’aide d’un formulaire de dossier préformé. Nous avons recruté 119 patients atteints de COVID-19 confirmé qui ont donné leur consentement pour une utilisation complète des échantillons, admis du 21 juin 2020 au 22 octobre 2021 à l’hôpital universitaire de Chosun, en Corée du Sud. Notre objectif était d’examiner l’association clinique entre l’antigénémie et l’ARNémie. Tous les patients sélectionnés ont été cliniquement confirmés positifs au SRAS-CoV-2 à l’aide de plusieurs méthodes de diagnostic, y compris la réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse en temps réel (qRT-PCR) avec la confirmation de plus de deux gènes cibles, d’une culture cellulaire ou d’un ≥ multiplication par quatre ou séroconversion en termes de titre d’anticorps contre le SRAS-CoV-2 (test immuno-enzymatique [ELISA] ou test d’anticorps par immunofluorescence indirecte). De plus, 81 échantillons de sérum/plasma d’individus en bonne santé sans symptômes cliniques, sans antécédents de COVID-19 et avec des résultats qRT-PCR nasopharyngés négatifs ont été utilisés comme échantillons de contrôle pour le test de sensibilité.
Échantillonnage et extraction d’ARN
Du sang périphérique a été collecté auprès de tous les patients et des échantillons de sérum/plasma de 200 µL provenant de sang frais ont été utilisés pour l’extraction de l’acide ribonucléique (ARN). Parallèlement, des échantillons d’expectorations auto-collectés auprès des patients ont été dilués dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), mélangés au vortex et centrifugés par impulsion pendant 1 min, et 200 μL de surnageant ont été soumis à une extraction d’ARN. Les écouvillons nasopharynx ont été directement collectés dans les kits commerciaux UTM™ contenant 1 ml d’un milieu de transport viral (NobleBio, Oldenzaal, Pays-Bas) par un médecin, et 200 µL ont été utilisés pour l’extraction de l’ARN. L’ARN viral a été extrait par le kit Real-prep Viral DNA/RNA (Biosewoom, Séoul, Corée du Sud) à l’aide d’un instrument entièrement automatisé (système Real-Prep, Biosewoom).
Réaction en chaîne par polymérase avec transcription inverse en temps réel (qRT-PCR) pour la détection du SARS-CoV-2
Pour le test qRT-PCR du gène de la protéine de nucléocapside (NP), des amorces et des sondes ont été conçues en interne, nCov-NP_572F (5′-GCAACAGTTCAAGAAATTC-3′), nCov-NP_687R (5′-CTGGTTCAATCTGTCAAG-3′) et nCov-NP_661P (5′-FAM-AAGCAAGAGCAGCATCACCG-BHQ1-3′). Le cyclage thermique a été effectué comme suit : 50 °C pendant 10 min pour la transcription inverse, un cycle de 95 °C pendant 30 s pour la préincubation, 95 °C pendant 5 s à 57 °C pour l’amplification et 45 cycles pour la détection des données. Pour les gènes cibles E (codant la protéine d’enveloppe) et RdRp (codant l’ARN polymérase dépendante de l’ARN), les kits Kogene (Kogene Biotech Co., Ltd., Séoul, Corée du Sud) et SD (SD Biotechnologies Co., Ltd., Séoul, Corée du Sud) ont été utilisés et l’amplification a été réalisée conformément aux instructions du fabricant. Pour la cible NP, la qRT-PCR a été réalisée dans un bloc thermique quantitatif en temps réel Exicycler™ 96 (Bioneer, Smiths Parish, Bermudes), et pour les kits Kogene et SD, le système de détection PCR en temps réel CFX96 Touch™ (Biorad, Hercules, CA, États-Unis) a été utilisé. Les valeurs de seuil de cycle (Ct) ont été fixées à ≤ 40 pour le gène de référence et ont été supposées indiquer un résultat positif.
Culture de cellules
Pour l’identification du SRAS-CoV-2 en culture, des monocouches de cellules Vero E6 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal et une solution antibiotique 1 × pénicilline-streptomycine (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37 °C. Ensuite, 200 µL d’un échantillon d’écouvillon non congelé dans un milieu de transport viral (kit UTM™, NobleBio) dilué avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (Welgene, Taipei, Fujian, Chine) ont été inoculés à la monocouche de cellules Vero cultivées. Après deux passages, la prolifération virale a été confirmée par qRT-PCR avec une valeur Ct confirmatoire de 16,17.
Sandwich ELISA pour l’antigénémie
Le test d’antigénémie de la protéine de nucléocapside (N) des patients atteints et non atteints de COVID-19 a été réalisé à l’aide de la technologie SIMOA (Single Molecular Array) avec un test ELISA sandwich à base de microbilles paramagnétiques. Le kit de test SIMOA SARS-CoV-2 N Protein Advantage (Quanterix Corp, Boston, MA, États-Unis, PN/103806) est un immuno-essai numérique qui mesure quantitativement la protéine de nucléocapside du SARS-CoV-2 dans le sérum et le plasma humains. Le plasma ou le sérum obtenu à partir de sang frais a été congelé après aliquotage pour minimiser la dégradation des protéines due aux cycles de congélation-décongélation et décongelé à température ambiante avant utilisation pour le test d’antigénémie. En bref, chaque puits de microplaques ELISA à 96 puits (plaques Quanterix®) a été chargé avec une dilution 4 × de plasma ou de sérum et analysé dans l’instrument Simoa HD-X (Quanterix) à l’aide d’un immuno-essai en deux étapes. Pour la détection, l’incubation a été réalisée avec l’anticorps cible recouvert de billes paramagnétiques, d’un échantillon et d’un anticorps biotinylé (SIMOA Guide Quanterix). La protéine de nucléocapside présente dans l’échantillon a été capturée à l’aide de billes recouvertes d’anticorps liées à l’anticorps biotinylé et détectée simultanément comme décrit précédemment18,19.
ELISA indirect
Un test ELISA indirect pour le SARS-CoV-2 a été réalisé à l’aide d’une protéine de nucléocapside recombinante (Bioapp. Inc., Pohang, Corée du Sud) pour déterminer les titres sérologiques d’immunoglobuline G (IgG), d’immunoglobuline M (IgM) et d’anticorps totaux. Des échantillons de sérum congelés ont été décongelés à température ambiante et utilisés pour un test ELISA indirect. En bref, 100 µL de 2 µg/mL de protéine de nucléocapside recombinante du SARS-CoV-2 (Bioapp. Inc.) ont été enduits dans une microplaque ELISA à 96 puits (Thermo Fisher Scientific) avec un tampon carbonate-bicarbonate, avec une incubation pendant la nuit à 4 °C. Les plaques ELISA ont été lavées avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, puis bloquées pendant 2 heures à 37 °C avec 5 % de lait écrémé dans un tampon de blocage. Les plaques ont été lavées et incubées pendant 2 heures supplémentaires à 37 °C avec les échantillons de sérum dilués 100 fois dans un tampon de blocage. Après lavage, un anticorps secondaire (anticorps IgG anti-humain de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort) a été détecté. [1:6000, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Cat A18805]anticorps anti-IgM humaine [1:3000, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Cat 31415]ou anticorps anti-anticorps total humain [1:40,000; Thermo Fisher Scientific, Cat 31418]) a été ajouté et incubé à nouveau pendant 1 h à 37 °C. Les plaques ont été lavées à nouveau et 50 µL du substrat 3,3′5,5′-tétraméthylbenzidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) ont été ajoutés et incubés à température ambiante (20-30 °C) pendant 30 min dans l’obscurité. De plus, 25 µL de H2SO4 1 M ont été ajoutés pour arrêter la réaction et la densité optique a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à deux microplaques Epoch™ (Kitchener, ON, Canada) à 450 nm (OD450). Les valeurs limites et la positivité pour le SARS-CoV-2 ont été définies comme décrit précédemment20.
Méthodes statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel MedCalc 20·013 (Ostende, Belgique) et d’IBM SPSS Statistics pour Windows, version 26.0. (IBM Corp., Armonk, NY, États-Unis) et GraphPad Prism 9 (San Diego, Californie, États-Unis). La sensibilité, la spécificité et la précision du test ont été évaluées à l’aide d’une analyse de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC). Les intervalles de confiance pour la sensibilité, la spécificité et l’exactitude sont des intervalles de confiance « exacts » de Clopper-Pearson21. Pour déterminer le taux de survie à 40 jours, une analyse de survie de Kaplan – Meier a été réalisée sur la base de la concentration d’antigénémie. Les variables quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± écart type et n (%) pour les variables normalement distribuées. Les valeurs moyennes ont été comparées à l’aide de tests t pour les variables continues et se sont révélées normalement distribuées. Les valeurs P comparant les patients atteints de COVID-19 présentant des signes d’antigénémie et d’ARNémie à ceux sans antigénémie ni ARNémie ont été calculées à l’aide du test Mann-Whitney U ou du test exact de Fisher, selon le cas.
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