Caractérisation in vitro et in vivo de la résistance du SRAS-CoV-2 à l’ensitrelvir

Éthique

Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux réglementations de l’Université de Tokyo en matière de soins et d’utilisation des animaux, qui ont été approuvées par le Comité d’expérimentation animale de l’Institut des sciences médicales de l’Université de Tokyo. Le comité a reconnu et accepté à la fois la responsabilité légale et éthique des animaux, comme spécifié dans les Lignes directrices fondamentales pour la bonne conduite de l’expérimentation animale et des activités connexes dans les instituts de recherche universitaires sous la juridiction du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et Technologie du Japon.

Déclaration de biosécurité

Toutes les expériences avec le SRAS-CoV-2 ont été réalisées dans des laboratoires de confinement de niveau 3 de biosécurité renforcée à l’Université de Tokyo, qui sont approuvés pour une telle utilisation par le ministère de l’Agriculture, des Forêts et de la Pêche et le ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être, Japon . Toutes les expériences ont été menées par des scientifiques titulaires d’un doctorat qui sont très expérimentés dans de telles études. Toutes les personnes travaillant avec le SRAS-CoV-2 ont été vaccinées plusieurs fois avec les vaccins COVID-19. Le personnel travaillant dans le BSL-3 amélioré porte des combinaisons jetables et des respirateurs à adduction d’air filtré. L’installation BSL-3 améliorée de l’Université de Tokyo comprend un accès contrôlé, la décontamination des effluents, une pression d’air négative, des autoclaves à double porte, de l’air d’alimentation et d’évacuation filtré HEPA et des registres étanches sur les conduits connectés aux isolateurs de cages pour animaux et aux enceintes de sécurité biologique . La structure est testée régulièrement en cas de chute de pression. Tout le personnel suit une formation en biosécurité et BSL-3 avant de participer à des expériences de niveau BSL-3. Des formations de remise à niveau sont programmées régulièrement. L’inventaire des virus, sécurisé derrière deux barrières physiques, est vérifié régulièrement. L’inventaire des virus est soumis une fois par an au ministère de l’Agriculture, des Forêts et de la Pêche et au ministère de la Santé, du Travail et des Affaires sociales du Japon. Des procédures de réponse aux accidents de laboratoire sont établies.

Cellules

Les cellules VeroE6/TMPRSS2 (JCRB 1819) ont été propagées dans le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 mg/ml de généticine (G418 ; Invivogen) et 5 μg/ml de plasmocine prophylactique (Invivogen). Les cellules VeroE6-TMPRSS2-T2A-ACE2 ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % de FBS, 100 U/ml de pénicilline-streptomycine et 10 µg/ml de puromycine. Les cellules HEK293T ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de FBS. Toutes les cellules ont été maintenues à 37 °C avec 5 % de CO₂. Les cellules ont été régulièrement testées pour la contamination par les mycoplasmes en utilisant la PCR et confirmées comme étant exemptes de mycoplasmes.

Antiviraux

L’ensitrelvir (S-217622) a été gracieusement fourni par Shionogi Co., Ltd. Les composants actifs du remdesivir (GS-441524), du molnupiravir (EIDD-1931) et du nirmatrelvir (PF-07321332) ont été achetés auprès de MedChemExpress. Les composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde pour les expériences in vitro ou dans de la méthylcellulose à 0,5 % pour les expériences in vivo avant utilisation.

Sélection de la résistance du SRAS-CoV-2 à l’ensitrelvir

La variante delta du SRAS-CoV-2 (hCoV-19/USA/WI-UW-5250/2021) a été passée séquentiellement cinq fois au total en présence d’ensitrelvir à 0,25, 0,5, 1 ou 5 μM dans des cellules VeroE6/TMPRSS2 . Au total, 12 clones ont été purifiés à partir des virus passés par purification sur plaque. La séquence nucléotidique Nsp5 de chaque clone a été déterminée par séquençage Sanger.

Sauvetage de virus à l’aide d’un chromosome artificiel bactérien (BAC)

La séquence nucléotidique du génome complet du variant delta du SRAS-CoV-2 (hCoV-19/USA/WI-UW-5250/2021) a été assemblée dans le vecteur pBeloBAC11 pour générer des clones d’ADNc infectieux sous le contrôle d’un promoteur de cytomégalovirus comme décrit précédemment³⁰. Les mutations responsables des substitutions M49L, E166A et M49L/E166A dans nsp5 ont été introduites lors de l’étape de PCR. Pour sauver ces virus, pBeloBAC11 codant pour le type sauvage, Nsp5-M49L, Nsp5-E166A ou Nsp5-M49L/E166A a été transfecté dans des cellules HEK293T. A 3 jours post-transfection, le surnageant contenant les virus a été collecté et inoculé sur des cellules VeroE6/TMPRSS2 à 37°C pour préparer des stocks de virus. Les virus de stock ont ​​été séquencés en profondeur pour confirmer l’absence de mutations indésirables, et aucune position ne contenait de nucléotides indésirables dépassant 10 % de la population dans tous les virus de stock.

Analyse approfondie des séquences

Le génome entier du SRAS-CoV-2 a été amplifié en utilisant un protocole de réseau ARTIC modifié dans lequel certaines amorces ont été remplacées ou ajoutées³⁶. En bref, l’ARN viral a été extrait à l’aide d’un kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN). L’ADNc a été synthétisé à l’aide d’un kit Lunar-Script RT SuperMix (New England BioLabs) et soumis à une PCR multiplexée dans deux pools en utilisant les amorces ARTIC-N1 v5 et l’ADN polymérase Q5 Hot Start (New England BioLabs). Les bibliothèques d’ADN pour Illumina NGS ont été préparées à partir d’amplicons regroupés à l’aide d’un kit de bibliothèque d’ADN QIAseq FX (QIAGEN), puis analysées à l’aide du système iSeq100 en mode apparié de 150 pb à l’aide d’un réactif iSeq 100 i1 v2 (cycle 300) trousse (Illumina). Les lectures ont été assemblées par CLC Genomics Workbench (version 22, Qiagen).

Test de réduction de la mise au point

Les sensibilités aux antiviraux ont été déterminées à l’aide d’un test de réduction de focalisation, comme indiqué précédemment^5,6,7. En bref, les cellules VeroE6-TMPRSS2-T2A-ACE2 dans des plaques à 96 puits ont été infectées avec le virus indiqué à 100–400 unités de formation de foyer/puits. Après incubation à 37 ° C pendant 1 h, l’inoculum a été remplacé par 1% de méthylcellulose 400 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) dans un milieu de culture contenant des dilutions en série des composés antiviraux. Les cellules ont été incubées pendant 18h à 37°C puis fixées au formol. Les cellules ont été colorées avec un anticorps monoclonal de souris contre la nucléoprotéine du SRAS-CoV-2, clone N45 (TAUNS Laboratories, Inc., Japon), suivi d’une immunoglobuline anti-souris de chèvre marquée à la peroxydase de raifort (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Les foyers ont été visualisés en utilisant le substrat TrueBlue (SeraCare Life Sciences). Les nombres de foyers ont été quantifiés à l’aide d’un analyseur ImmunoSpot S6, du logiciel ImmunoCapture et du logiciel BioSpot (Cellular Technology). La concentration inhibitrice à 50 % (IC₅₀) et les intervalles de confiance à 95 % ont été calculés à l’aide de GraphPad Prism 9.3.0 (GraphPad Software).

Cinétique de croissance in vitro

Les cellules VeroE6/TMPRSS2 ont été infectées avec le virus indiqué à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,001. Après incubation à 37 °C pendant 1 h, l’inoculum a été remplacé par du milieu avec ou sans ensitrelvir 20 μM. Les surnageants de culture cellulaire ont été collectés à 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 72 et 96 h après l’infection. Les titres de virus ont été déterminés par l’utilisation d’un essai sur plaque dans des cellules VeroE6/TMPRSS2.

Infection expérimentale de hamsters syriens

Des hamsters syriens mâles âgés de cinq à six semaines (Japan SLC) ont été utilisés dans cette étude. Pour l’étude de pathogénicité, les hamsters (n = 5) ont été inoculés par voie intranasale avec 10⁵ unité formant plaque (PFU) du virus indiqué. Les poids corporels ont été mesurés quotidiennement avant l’inoculation et pendant 10 jours après l’infection (dpi). Paramètres respiratoires [Penh (a nonspecific assessment of breathing patterns) and Rpef (a measure of airway obstruction)] ont également été mesurés en utilisant un système de pléthysmographie du corps entier (PrimeBioscience) comme décrit précédemment^37,38.

Pour le titrage du virus et l’analyse pathologique, les hamsters (n = 10) ont été infectés par voie nasale avec 10⁵ PFU du virus indiqué. A 3 et 6 dpi, les animaux (n= 5 par point de temps) ont été euthanasiés et les cornets nasaux et les poumons droits ont été prélevés. Les titres de virus dans ces organes ont été déterminés en utilisant des tests de plages sur des cellules VeroE6/TMPRSS2. Les poumons gauches ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS et traités pour l’inclusion de paraffine. Les blocs de paraffine ont été coupés en sections de 3 μm d’épaisseur et montés sur des lames de verre revêtues de silane, puis colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour un examen histopathologique. Pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2, une hybridation in situ a été réalisée à l’aide d’un kit de détection rouge RNA scope 2.5 HD (Advanced Cell Diagnostics) avec une sonde antisens ciblant le gène de la nucléocapside du SARS-CoV-2 (Advanced Cell Diagnostics) comme décrit précédemment³⁹. Des coupes de tissus ont également été traitées pour la coloration immunohistochimique avec un anticorps monoclonal de lapin pour la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV (Sino Biological), qui réagit de manière croisée avec la protéine de nucléocapside du SRAS-CoV-2. Des réactions spécifiques antigène-anticorps ont été visualisées au moyen d’une coloration au tétrachlorhydrate de 3,3′-diaminobenzidine en utilisant le système Dako Envision (Dako Cytomation). Les scores histopathologiques d’inflammation dans les régions alvéolaires ont été déterminés en fonction du pourcentage d’inflammation alvéolaire dans une zone donnée d’une section pulmonaire prélevée sur chaque animal de chaque groupe en utilisant le système de notation suivant³⁸: 0, pas d’inflammation ; 1, zone affectée (≤1%); 2, zone affectée (>1%, ≤10%); 3, zone affectée (>10%, ≤50%); 4, zone affectée (>50 %). Un point supplémentaire était ajouté lorsqu’un œdème pulmonaire et/ou une hémorragie alvéolaire était observé. Par conséquent, les scores histopathologiques d’inflammation dans les alvéoles pour les animaux individuels variaient de 0 à 5.

Pour l’étude de traitement, virus de type sauvage ou Nsp5-M49L/E166A à 10⁵ PFU a été inoculé à des hamsters (n= 20). A 1 jpi, traitement par l’ensitrelvir à 60 mg/kg deux fois par jour (n= 5), nirmatrelvir à 250 mg/kg deux fois par jour (n= 5), ou molnupiravir à 250 mg/kg deux fois par jour (n= 5) a été lancé^40,41 et continué jusqu’à 3 dpi. Les hamsters restants (n= 5) ont reçu 0,5 % de méthylcellulose. Les animaux ont été euthanasiés à 4 dpi et leurs cornets nasaux et leurs poumons ont été prélevés pour le titrage du virus sur des cellules VeroE6/TMPRSS2.

analyses statistiques

Le logiciel GraphPad Prism version 9.3.0 a été utilisé pour calculer Pvaleurs. La cinétique de croissance du virus in vitro, le poids corporel, Penh et Rpef ont été comparés en utilisant une ANOVA à deux voies suivie de comparaisons multiples de Dunnett. Les titres de virus chez les hamsters ont été comparés en utilisant une ANOVA à une voie suivie de comparaisons multiples de Tukey. Les différences entre les groupes ont été considérées comme significatives pour Pvaleurs < 0,05.

Résumé des rapports

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.