Des études ont été menées sur des souris NOD/SCID et NOG,élevées et maintenues dans un center spécialisé. Ces souris, âgées de quatre semaines, ont servi de sujets pour cette recherche. Elles étaient logées dans des conditions contrôlées, à une température constante de 25 °C, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Un cycle lumière/obscurité de 12 heures était respecté.

Des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines dérivées de la moelle osseuse ont été utilisées, répondant à des normes de qualité spécifiques. Des cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+ humaines provenant du sang de cordon ombilical ont également été utilisées, soit achetées, soit isolées à partir de dons volontaires. Les CSM humaines ont été cultivées dans un milieu d’expansion spécifique, enrichi en sérum fœtal bovin et en facteurs de croissance. Les CSH CD34+ humaines ont été cultivées dans un milieu de Dulbecco modifié, également enrichi en sérum fœtal bovin et en antibiotiques.Des lymphocytes T humains ont été isolés à partir d’échantillons autologues de sang de cordon ombilical par centrifugation sur gradient de densité Ficoll-Paque. Les cellules T CD3+ ont ensuite été purifiées à l’aide d’un kit d’isolement de cellules T humaines, atteignant une pureté supérieure à 95 %. Ces cellules T CD3+ purifiées ont été activées avec des billes Dynabeads CD3/CD28 activatrices de cellules T humaines pendant 24 heures avant d’être collectées pour une utilisation ultérieure.

Des souris humanisées ont été créées en infusant différentes combinaisons de cellules, notamment des CSH CD34+ seules, des CSH/cellules T, des CSH/CSM et des CSH/CSM/T, à des souris NOD/SCID âgées de quatre semaines. Ces souris avaient été préalablement irradiées. Quatre semaines après la transplantation, des échantillons de sang ont été prélevés sur chaque souris perfusée avec des CSH humaines et analysés soit par coloration pour des marqueurs de surface spécifiques à l’homme (hCD45), soit par dépistage des signaux Alu humains par PCR en temps réel.

Des CSH CD34+ ont été cultivées seules ou en combinaison avec des CSM de moelle osseuse et des cellules T activées autologues pendant 14 jours. Les cellules ont été collectées et colorées en surface avec des anticorps anti-humains CD11b-APC, anti-humains CD3-PerCP et anti-CD105-PE-Cyanine7, suivies d’un marquage intracellulaire avec un anticorps anti-myéloperoxydase (MPO)-FITC. L’analyze des données a impliqué l’exclusion des cellules CD3- et CD105-double négatives en tant que cellules différenciées CSH, suivie d’une analyse FACS pour déterminer les niveaux d’expression de CD11b+MPO+. Pour l’analyse de la reconstitution des CSH in vivo,des cellules de moelle osseuse provenant des différents groupes expérimentaux de souris humanisées (12 à 16 semaines après la transplantation de cellules) ont été collectées et colorées avec des anticorps anti-humains CD45-PE,anti-souris CD45-APC et anti-humains MPO-FITC. Une analyse FACS a été effectuée pour évaluer la fréquence des cellules humaines CD45+ et des cellules exprimant la MPO humaine.

Après 14 jours de co-culture, les cellules en suspension ont été récoltées et lavées trois fois. L’ARN total a été extrait à l’aide du réactif Trizol et converti en ADNc à l’aide d’un kit ReverTra Ace, conformément aux instructions du fabricant. La PCR en temps réel a été réalisée à l’aide d’un système ABI Prism 7900.pour chaque échantillon, la valeur du seuil de cycle (Ct) a été déterminée. Les résultats ont été normalisés par rapport aux niveaux du gène GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase) sur la même plaque. Le niveau d’expression de l’ARNm pour différents groupes de cellules a été calculé à l’aide de la méthode 2ΔCt. Des amorces spécifiques pour chaque gène ont été conçues comme suit :

Humain GAPDH,GAGTCAACGGATTTGGTCGT (amorce sens,F),TTGATTTTGGAGGGATCTCG (amorce antisens,R) ; IL-17 A,CCGCCACTTGGGCTGCATCA (F),GGGCAGTGTGGAGGCTCCCT (R) ; protéine A8 de liaison au calcium S100 (S100A8),GGCAAGTCCGTGGGCATCATGT (F),CAGGTCATCCCTGTAGACGGCA (R) ; MPO,GGACCACGGCCTCCCAGGAT (F),GGTTCCTCAGCACCGTGCCC (R) ; GATA1 : AACCGGCCACTGACCATGCG (F),CCTTCGGCTGCTCCTGTGCC (R) ; TMF1 : AGGGGAGCGAAGCCGTTCCT (F),TCATCGCCCCTCCTCAGCCG(R) ; IL7R : GCACGCTGCCCCCTCCATTT (F),GGCTGACCCTGAGCAACTGGG (R) ; NOX2 : CTCTGAACTTGGAGACAGGCAAA (F),CACAGCGTGATGACAACTCCAG (R) ; LCN2 : ACGGGAGAACCAAGGAGCTGAC (F),TGGGACAGGGAAGACGATGTGG (R).

Du sérum de souris a été collecté un jour après l’infection par Pseudomonas aeruginosa. Les niveaux d’IL-6 et d’IL-8 humaines ont ensuite été mesurés à l’aide de kits ELISA commerciaux,en suivant les protocoles du fabricant.

La moitié des tissus pulmonaires ont été rincés avec du HBSS froid et coupés en tranches de 500 µm. Les échantillons ont été incubés dans du HBSS supplémenté avec 10 % de FBS, de la DNase (75 µg/mL) et de la collagénase D (1 mg/mL) pendant 30 à 60 minutes à 37 °C. Après la digestion, la suspension cellulaire résultante a été filtrée à travers un filtre stérile, lavée avec du PBS et colorée avec des anticorps anti-humains CD45-PE, anti-souris CD45-APC et anti-humains MPO-FITC. une analyse par cytométrie de flux a été réalisée pour déterminer la fréquence des cellules humaines CD45+ et des cellules exprimant la MPO humaine.

Les cellules ont été récoltées et lavées une fois avec un tampon FACS (PBS contenant 1 % de FBS) pour empêcher la liaison non spécifique, puis colorées avec des anticorps conjugués à un fluorochrome spécifiques aux marqueurs de surface indiqués pendant 30 minutes sur glace.Après l’incubation, les cellules ont été lavées trois fois avec un tampon FACS pour éliminer les anticorps non liés, remises en suspension et analysées à l’aide d’un cytomètre de flux Cytek Aurora (Cytek). Une compensation appropriée a été incluse pour assurer un gating et une détection des marqueurs précis. les données ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo (version 10.8.0) en suivant des stratégies de gating standard pour exclure les débris et les cellules mortes, avec des signaux de fluorescence ajustés en fonction des contrôles internes. Les clones d’anticorps et leurs fluorochromes correspondants sont énumérés ci-dessous : anti-humain CD45-BV421 (Clone : HI30, BioLegend, Cat#304,032) ; anti-humain

Étude de l’Hématopoïèse Humaine in vivo dans un Modèle Souris Humanisé

Cet article détaille une étude sur la reconstitution hématopoïétique humaine chez des souris immunodéficientes. Des souris NOD/SCID et NOG ont été utilisées comme modèles pour étudier le développement et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) humaines.

Méthodologie

souris: Des souris NOD/SCID et NOG de quatre semaines, élevées en conditions contrôlées (25°C, cycle lumière/obscurité 12h/12h, accès libre à la nourriture et à l’eau), ont été utilisées.

Cellules: Plusieurs types de cellules humaines ont été utilisés :

Cellules souches mésenchymateuses (CSM): Dérivées de moelle osseuse humaine.

Cellules souches hématopoïétiques (CSH CD34+): Du sang de cordon ombilical, soit achetées, soit isolées à partir de dons.

Lymphocytes T humains (CD3+): Isolés de sang de cordon ombilical,purifiés (>95%) et activés.

Humanisation des souris: Les souris NOD/SCID ont été irradiées avant l’infusion de différentes combinaisons de cellules : CSH CD34+ seules, CSH/cellules T, CSH/CSM, et CSH/CSM/T.

Analyses: Différentes analyses ont été menées, incluant :

Cytométrie en flux (FACS): Pour l’analyse de l’expression de marqueurs de surface (CD45, CD3, CD11b, CD105, MPO) sur les cellules humaines.

PCR en temps réel: Pour quantifier l’expression de gènes spécifiques (GAPDH,IL-17A,S100A8,MPO,GATA1,TMF1,IL7R,NOX2,LCN2).

ELISA: Pour la quantification des cytokines humaines (IL-6, IL-8) dans le sérum de souris.

Résumé des analyses et des marqueurs

| Analyse | Cellules analysées | Marqueurs | technique |

|——————-|—————————————————-|———————–|—————–|

| Reconstitution CSH in vivo | Sang et moelle osseuse de souris humanisées | hCD45, mCD45, hMPO | FACS |

| Différenciation CSH in vitro | CSH cultivées avec ou sans CSM et cellules T | CD11b, CD3, CD105, MPO | FACS |

| Expression génique | Cellules cultivées in vitro | GAPDH, IL-17A, etc. | PCR en temps réel |

| Cytokines | Sérum de souris | IL-6, IL-8 | ELISA |

Amorces utilisées pour la PCR en temps réel

| Gène | Amorce sens (F) | Amorce antisens (R) |

|——————-|————————————————-|————————————————-|

| Humain GAPDH | GAGTCAACGGATTTGGTCGT | TTGATTTTGGAGGGATCTCG |

| IL-17A | CCGCCACTTGGGCTGCATCA | GGGCAGTGTGGAGGCTCCCT |

| S100A8 | GGCAAGTCCGTGGGCATCATGT | CAGGTCATCCCTGTAGACGGCA |

| MPO | GGACCACGGCCTCCCAGGAT | GGTTCCTCAGCACCGTGCCC |

| GATA1 | AACCGGCCACTGACCATGCG | CCTTCGGCTGCTCCTGTGCC |

| TMF1 | AGGGGAGCGAAGCCGTTCCT | TCATCGCCCCTCCTCAGCCG |

| IL7R | GCACGCTGCCCCCTCCATTT | GGCTGACCCTGAGCAACTGGG |

| NOX2 | CTCTGAACTTGGAGACAGGCAAA | CACAGCGTGATGACAACTCCAG |

| LCN2 | ACGGGAGAACCAAGGAGCTGAC | TGGGACAGGGAAGACGATGTGG |

Conclusion

Cette étude utilise un modèle souris humanisé pour étudier la reconstitution et la différenciation des CSH humaines, fournissant des informations précieuses sur l’hématopoïèse.