Introduction
Table of Contents
L’obstruction de l’uretère causée par des calculs ou des tumeurs est une cause fréquente d’hydronéphrose, qui peut à terme entraîner le développement d’une maladie rénale chronique (MRC) progressive. Il a été constaté qu’une fibrose rénale interstitielle (FRI) progressive et l’inflammation représentent les principales caractéristiques pathologiques de la MRC. Elles se manifestent par une production accrue de fibrine, une libération massive de facteurs pro-inflammatoires et une infiltration de cellules inflammatoires dans le rein. La prévalence mondiale de la MRC est estimée entre 8 et 16 %. La FRI est considérée comme une conséquence fréquente de toutes les MRC, caractérisée par une inflammation, l’activation et la migration des myofibroblastes, le dépôt et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC). au cours de la MRC, la matrice fibrotique se dépose continuellement, entraînant la destruction de la structure de l’organe et la réduction de l’apport sanguin, ce qui conduit finalement à un dysfonctionnement de l’organe. La fibrose du tissu rénal réduit sa capacité d’auto-réparation, conduisant finalement à une insuffisance rénale. L’incidence et la mortalité de la MRC continuant d’augmenter d’année en année, il est clair que de nouvelles stratégies sont nécessaires de toute urgence pour prévenir le développement de la MRC et améliorer la survie des patients.
Pour mieux étudier les méthodes de traitement de la MRC, l’obstruction unilatérale de l’uretère (UUO) a été largement utilisée pour développer des modèles animaux de FRI, la ligature de l’uretère gauche représentant la méthodologie la plus répandue. Le modèle d’UUO induit expérimentalement chez les rongeurs est censé reproduire la physiopathologie de la maladie rénale obstructive chronique humaine, facilitant ainsi l’étude des mécanismes de la FRI et l’exploration de nouveaux médicaments pour le traitement de la fibrose. le rein après obstruction urétérale subit un certain nombre d’événements importants, notamment un étirement mécanique, l’activation du système rénine-angiotensine-aldostérone, la perte de cellules épithéliales rénales, l’infiltration de macrophages, l’inflammation, le stress oxydatif et l’activation des fibroblastes. Collectivement, ces événements conduisent à la formation éventuelle de FRI. Histologiquement, les reins obstrués sont caractérisés par les éléments suivants : dilatation tubulaire, dilatation interstitielle, perte parenchymateuse, infiltration de cellules inflammatoires et accumulation de MEC. les cellules inflammatoires infiltrées produisent et libèrent une variété de cytokines profibrotiques et de facteurs de croissance, y compris le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), qui active les voies de signalisation régulées (basées sur Smad) et non régulées (non basées sur Smad), induisant la prolifération des fibroblastes interstitiels et la change des myofibroblastes. Cela conduit à un dépôt excessif de MEC et à une FRI. Par conséquent, l’inhibition ciblée de la réponse inflammatoire ou de la voie de signalisation TGF-β1/Smad peut représenter une stratégie thérapeutique potentielle pour l’inhibition de la FRI. Heureusement, la longue histoire de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement de la FRI est bien documentée. Les effets régulateurs multi-cibles et multi-liens de la MTC offrent une voie prometteuse pour le traitement de la FRI. L’émodine est une MTC efficace pour les maladies fibrotiques, dont il a été démontré qu’elle réduit efficacement la prolifération et le métabolisme des cellules épithéliales tubulaires rénales, atténuant ainsi les dommages causés au néphron préservé par un métabolisme élevé. De plus, il a été démontré qu’elle inhibe efficacement la prolifération et la division des fibroblastes rénaux et favorise leur apoptose, tout en réduisant l’infiltration de cellules inflammatoires dans les reins endommagés. Il a également été démontré que l’émodine atténue la FRI en inhibant le TGF-β1 dans les modèles murins d’UUO et induits par la doxorubicine. cependant, l’request de l’émodine présente encore quelques inconvénients, qui se manifestent principalement par des effets secondaires toxiques évidents.Il a été rapporté que l’émodine peut induire une cytotoxicité dans les hépatocytes primaires de rat en inhibant l’activité enzymatique de la NADPH quinone réductase. Il a été démontré qu’une governance prolongée ou à forte dose d’émodine peut réduire l’activité de la glucuronidase et induire une toxicité hépatique chez l’homme et le rat, ce qui suggère une association potentielle entre ces variables. De plus,l’émodine a une solubilité dans l’eau extrêmement faible,ce qui limite considérablement sa biodisponibilité. par conséquent, il est urgent de développer un système d’administration d’émodine efficace pour améliorer le traitement de la MRC.
Matériels et méthodes
Animaux d’expérience
Les animaux d’expérience étaient des souris mâles Balb/c de qualité SPF, âgées de 6 à 8 semaines et pesant de 18 à 20 g. Les animaux ont été achetés au Centre d’animaux de laboratoire du Centre des sciences de la santé de l’Université de Pékin et conservés dans un laboratoire SPF à une température de 18 à 22°C, une humidité de 50 à 70% et un cycle de lumière de 12 h. Cette expérience a été approuvée par le Comité d’éthique des animaux d’expérience du Troisième Hôpital de l’Université de Pékin (Éthique : LA2019206). De plus, l’expérience a suivi les directives de la norme nationale GB/T 35892–2018 de la République populaire de Chine, code d’examen éthique pour le bien-être des animaux d’expérience.
Réactif expérimental
DSPC, DSPE-PEG2000 et DSPE-PEG2000-NHS ont été achetés auprès de Xi’an Ruixi Biotechnology Co., LTD. DSPE-PEG2000-Cy5.5 a été acheté auprès de Shanghai Avito biomedical Co., LTD. L’émodine a été achetée auprès de Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LTD. In Vivo MAb anti-souris KIM-1 (αKIM-1) a été acheté auprès de Biox cell Biology. Les kits de test de créatinine (CREA), d’azote uréique sanguin (UREA), de transaminase glutamique-pyruvique (ALT) et de transaminase glutamique-oxaloacétique (AST) dans le sang de souris ont été achetés auprès de Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing. Les kits de test de viabilité/cytotoxicité Calcein-AM/PI live/Dead et le 3-(4,5)-diméthylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phényltétrazoliumromide (MTT) ont été achetés auprès de Beyotime biotechnology Co., LTD.Les kits ELISA TNF-α de souris et les kits ELISA IL-1β de souris ont été achetés auprès de Solarbio Biotechnology Co., LTD. D’autres réactifs de pureté analytique peuvent être achetés pour une utilisation directe dans les expériences sans purification supplémentaire.
Méthode expérimentale
Préparation et optimisation des Emo@KP MBs
Tout d’abord, le rapport d’alimentation optimal de αKIM-1 a été étudié. Étape 1 : DSPC, DSPE-PEG2000 et DSPE-PEG2000-NHS dissous dans de l’éthanol ont été mélangés uniformément selon le rapport molaire de 80:10:10 (masse totale : 1 mg) ; Étape 2 : le mélange lipidique a été injecté dans 1 mL de PBS dans un bain d’eau à ultrasons ; Étape 3 : Dialyse dans du PBS (poids moléculaire d’interception : 8000–14000 Da) pendant 1 jour pour éliminer le solvant organique afin d’obtenir des P NPs ; Étape 4 : La suspension obtenue par dialyse a été mise à réagir avec αKIM-1 à température ambiante conformément à différents rapports de masse (20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %), à l’abri de la lumière ; Étape 5 : Dialyse dans du PBS (poids moléculaire : 300000 Da) pendant 1 jour pour éliminer les anticorps non liés afin d’obtenir des KP NPs ; Étape 6 : Des KP NPs, du propylène glycol et du glycérol ont été ajoutés dans un flacon de pénicilline de 3 mL selon le rapport volumique de 80 % :10 % :10 %, puis remplis de gaz SF6, oscillation mécanique pendant 45 s, pour obtenir des KP MBs.Le rapport d’alimentation optimal a été déterminé en évaluant le taux de connexion de αKIM-1 et la taille des microbulles.
Ensuite, le rapport de dosage optimal de l’émodine a été étudié comme suit : Étape 1 : DSPC, DSPE-PEG2000 et DSPE-PEG2000-NHS dissous dans de l’éthanol ont été mélangés uniformément selon le rapport molaire de 80:10:10 (masse totale : 1 mg) ; Étape 2 : Le mélange lipidique a été soigneusement mélangé avec de l’émodine selon différents rapports médicament-lipide (1/15, 1/10, 1/8, 1/5, 1/3) ; Étape 3 : Le mélange de médicaments et de lipides a été injecté dans 1 mL de PBS sous ultrasons de bain d’eau ; Étape 4 : Dialyse dans du PBS (poids moléculaire : 8000–14000 Da) pendant 1 jour pour éliminer le solvant organique et l’émodine non encapsulée afin d’obtenir des Emo@P NPs ; Étape 5 : La suspension obtenue par dialyse a été mise à réagir avec la proportion appropriée de αKIM-1 obtenue par l’enquête précédente à température ambiante, à l’abri de la lumière ; Étape 6 : Dialyse dans du PBS (poids moléculaire : 300000 Da) pendant 1 jour pour éliminer les anticorps non liés afin d’obtenir des Emo@KP NPs ; Étape 7 : Des Emo@KP NPs, du propylène glycol et du glycérol ont été ajoutés dans un flacon de pénicilline de 3 mL selon le rapport volumique de 80 % :10 % :10 %, puis remplis de gaz SF6, des Emo@KP MBs ont été obtenus après une oscillation mécanique pendant 45 s. Le rapport d’alimentation optimal de l’émodine a été déterminé en évaluant le taux d’encapsulation, le taux de chargement et la taille des microbulles.
Pour préparer des Cy5.5-Emo@KP MBs, il suffit de remplacer DSPE-PEG2000-Cy5.5 par DSPE-PEG2000.
Mesure de la taille des Emo@KP mbs
Stabilité du chargement du médicament des Emo@KP MBs
L’émodine est un médicament lipophile qui est encapsulé dans la couche de coque des microbulles par interaction hydrophobe. Il fuit et précipite progressivement hors des microbulles en raison de la concentration plus élevée d’émodine dans les microbulles que dans le solvant. Afin d’étudier la stabilité du chargement du médicament in vivo et in vitro des Emo@KP MBs, les microbulles préparées ont été stockées à 37°C et 4°C. Aux points temporels définis (1, 2, 4, 8, 24 h), les microbulles ont été centrifugées à 800 tr/min pendant 5 min pour séparer la couche supérieure, qui a ensuite été injectée dans des réactifs organiques pour la détection de la teneur en émodine par spectroscopie d’absorption ultraviolet-visible-proche infrarouge (UV-VIS-NIR). La teneur en émodine dans les microbulles a été quantifiée,et le taux de fuite des microbulles a été calculé en fonction de la teneur en émodine. Le taux de fuite d’émodine a été calculé comme suit : 1 – (quantité d’émodine dans les Emo@KP MBs/quantité de médicament initialement chargée sur les Emo@KP MBs) × 100 %.
Caractérisation des Emo@KP NPs par microscopie électronique à transmission
Les Emo@KP MBs optimisés ont été placés dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits et soumis à UTMD (1,0 MHz, cycle deL’amino-conversion de la L-alanine, de l’acide L-aspartique et de l’α-cétoglutarate en pyruvate et oxaloacétate, respectivement, et la conversion du pyruvate et de l’oxaloacétate du NADH en NAD+, ont réduit l’absorbance à 340 nm. L’urée a été hydrolysée sous l’action de l’uréase pour former des ions ammonium, qui forment une substance bleue avec un agent chromogène phénol en milieu alcalin, proportionnelle à la teneur en urée, et présente un pic d’absorption caractéristique à 640 nm. la créatinine est hydrolysée en glycine, formant de l’aldéhyde et du H2O2 sous la catalyse de la créatinine amide hydrolase et de la créatine amino hydrolase, et le H2O2 peut être catalysé avec du 2,4-DCP et de la 4-aminoantipyrine pour former le composé rouge-violet quinonimines catalysé par la catalase, qui a un pic d’absorption caractéristique à 546 nm. Par conséquent, les valeurs d’absorbance à 340 nm, 640 nm et 546 nm ont été surveillées et les teneurs en ALT, AST, CREA et UREE ont été calculées en ajoutant le substrat correspondant au sérum de souris collecté.
Analyze histologique
après avoir disséqué les reins malades de chaque groupe, les reins ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, inclus dans de la paraffine et coupés en tranches d’une épaisseur de 4 μm. La coloration HE et la coloration de Masson ont été utilisées pour évaluer les changements pathologiques et le degré de dépôt de fibrine rénale.
Coloration immunohistochimique
Analyses statistiques
Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart type. Tous les graphiques statistiques ont été construits à l’aide du logiciel GraphPad Prism 10.0. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour évaluer si les différences entre les groupes étaient statistiquement significatives. * P ont été considérés comme statistiquement significatifs.
Résultats et discussions
Fabrication et caractérisation des MBs Emo@KP et conversion micro-nano in situ déclenchée par ultrasons
Afin d’obtenir des microbulles stables pour la délivrance simultanée d’émodine et d’αKIM-1,la composition des microbulles doit être soigneusement optimisée. Les NPs Emo@P ont d’abord été préparées à partir d’un mélange lipide-médicament de DSPC, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS et d’émodine par la méthode d’injection d’éthanol sous sonication au bain-marie.L’αKIM-1 a ensuite été conjugué aux NPs Emo@P via une réaction amide entre le groupe NHS actif de DSPE-PEG2000-NHS et les groupes amino d’αKIM-1 dans une solution PBS (pH 8,4). Pour obtenir le rapport approprié d’αKIM-1 aux NPs P, une série de rapports pondéraux (p/p) d’αKIM-1/nps P (mAb/NPs) de 20 % à 60 % ont été conçus pour préparer les NPs KP. L’efficacité de liaison finale et la teneur en αKIM-1 conjugué à la surface des NPs P sont répertoriées dans le Tableau S1 (Figure S1). Avec l’augmentation des rapports pondéraux (p/p) de mAb/NPs P, la quantité d’anticorps liée aux NPs P a augmenté progressivement de 14,37 ± 1,65 % à 29,27 ± 0,85 %. Toutes ces NPs KP ont ensuite été mélangées avec du propylène glycol et du glycérol, remplies d’hexafluorure de soufre (SF6) et oscillées mécaniquement pour obtenir les MBs KP (Figure 1). On peut observer que les NPs KP claires et transparentes (Figure S2A) sont devenues des mbs KP laiteuses (Figure S2B), ce qui a prouvé la préparation réussie des microbulles. Au cours du processus d’oscillation mécanique, il y a eu une conversion à haute fréquence entre les pressions positives et négatives, ce qui a déclenché l’instabilité du système, réduit la concentration d’équilibre de SF6 dans les NPs KP, diminué la solubilité et formé un grand nombre de noyaux de bulles dans la matrice. Ces noyaux de bulles ont progressivement grossi,ont formé de minuscules pores et sont finalement devenus des microbulles. leur distribution de taille a ensuite été étudiée (Figure S3). Cependant, compte tenu de l’efficacité de liaison et de la teneur en αKIM-1, nous avons sélectionné 40 % de mAb/NPs pour la préparation ultérieure des microbulles.
Les images au microscope optique ont montré que les MBs Emo@KP avaient pour la plupart une structure sphérique de 2 à 4 μm (Figure 2A), ce qui était en bon accord avec la distribution de taille mesurée par compteur Coulter (Figure 2B). Afin d’étudier la stabilité morphologique des MBs Emo@KP, elles ont été stockées dans un réfrigérateur à 4 °C et leur taille a été surveillée pendant 5 jours consécutifs (Figure 2C). Les résultats ont montré que la taille des MBs Emo@KP n’a pas fluctué de manière significative. De plus, la stabilité du chargement du médicament des MBs Emo@KP a été évaluée dans des conditions simulées in vivo (37 °C) et in vitro (4 °C). À 4 °C, la libération du médicament a été observée comme étant de (3,74 ± 0,11) % à 4 heures, (4,56 ± 0,32) % à 8 heures et (5,34 ± 0,37) % à 24 heures. À 37 °C, la libération du médicament a présenté une légère augmentation, atteignant (4,78 ± 0,37) % à 4 heures, (6,37 ± 0,35) % à 8 heures et (7,67 ± 0,51) % à 24 heures, qui sont toutes restées dans les limites acceptables. Les résultats susmentionnés ont indiqué que la stabilité des MBs Emo@KP était bonne et bien adaptée à sa délivrance de médicament in vivo (Figure 2D).
Le spectre d’absorption des MBs Emo@KP a montré un pic d’absorption caractéristique à ~430 nm, correspondant au pic d’absorption caractéristique de l’émodine. Le léger décalage de ce pic caractéristique par rapport à l’émodine devrait être dû à l’agrégation de ces molécules pendant le processus d’auto-assemblage. de plus, le spectre d’absorption UV-VIS-NIR des MBs Emo@KP a également changé à 280 nm, ce qui a été attribué au pic d’absorption des doubles liaisons conjuguées des résidus de tryptophane et des résidus de tyrosine dans αKIM-1 (Figure 2E). En outre, la présence d’αKIM-1 dans les microbulles a été observée au microscope à fluorescence à travers les anticorps secondaires fluorescents marqués. Ces résultats ont indiqué que l’émodine et l’αKIM-1 ont été chargées avec succès sur les NPs Emo@KP (figure 2F).
Pour explorer si les MBs Emo@KP pouvaient être converties en NPs Emo@KP, elles ont été exposées à des ultrasons (1 MHz, cycle de service de 10 %, 2 W/cm2) pendant 30 s. Les images TEM ont montré que les NPs Emo@KP avaient une taille de ~70 nm (Figure 2G), ce qui était plus petit que les mesures de diffusion de la lumière hydrodynamique (~110 nm) en raison de l’absence de couche d’hydratation (Figure 2H). Ces résultats ont confirmé que les MBs Emo@KP peuvent être efficacement converties en NPs Emo@KP après exposition aux ultrasons, favorisant davantage la transformation in vivo des MBs en NPs dans les tissus malades.Nous avons surveillé la charge de surface des NPs Emo@KP, et les résultats ont montré qu’elle était de −25,4 ± 0,32 mV, ce qui lui a permis de circuler dans le sang pendant une longue période et a évité d’être éliminée par le foie et la rate (Figure S7).
libération du médicament des MBs Emo@KP en réponse à l’UTMD
Évaluation de la biosécurité
Une bonne biocompatibilité est une condition préalable à l’utilisation de médicaments micro/nano in vivo. Tout d’abord, la biocompatibilité a été évaluée au niveau cellulaire en incubant les MBs Emo@KP avec des cellules HK-2 à différentes concentrations pendant 24 h. Ensuite, un test MTT standard et une coloration cellulaire Live/dead ont été appliqués. Les résultats ont montré qu’une concentration élevée de MBs Emo@KP (200 μg/mL) n’avait pas d’influence significative, et le taux de survie cellulaire était supérieur à 90 % (Figure 3A et B). Les résultats de la coloration cellulaire Live/Dead ont montré de forts signaux de fluorescence verte et presque aucun signal de fluorescence rouge, ce qui a en outre indiqué que l’utilisation de microbulles liées à des anticorps comme vecteurs de délivrance de médicaments avait une bonne biocompatibilité.
Ensuite, la biosécurité des MBs Emo@KP a été évaluée par des tests sanguins de routine, des tests biochimiques sanguins et une analyse histologique.Les MBs Emo@KP (200 μL, concentration d’émodine équivalente : 10 mg/kg) ont été injectées à des souris par la veine caudale, puis un examen sanguin de routine périphérique a été effectué avant l’injection (témoin) et 1, 2, 3 et 5 jours après l’injection. Il n’y a pas eu de changements significatifs dans tous les paramètres sanguins clés après l’injection de MBs Emo@KP, ce qui indique que les MBs Emo@KP n’ont pas causé d’infection ou d’inflammation indésirable (Figure 3C–J). Les principaux indices biochimiques sanguins des souris n’ont pas changé de manière significative, ce qui peut également prouver la conclusion ci-dessus.
Ensuite, 200 μL de DMSO ont été ajoutés et agités pendant 15 minutes. L’absorbance de 490 nm et 630 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques SPARK 10 M, et la viabilité cellulaire a été calculée en fonction de l’absorbance.La coloration de Masson a révélé une petite quantité de fibres de collagène bleues dans les tissus interstitiels du rein dès le premier jour post-opératoire. Avec le temps, le dépôt de collagène dans le tissu interstitiel rénal a augmenté, et la couleur bleue est devenue plus prononcée (Figure 4B).
Ces observations indiquent la réussite de la construction d’un modèle murin de fibrose rénale interstitielle (FRI), fournissant une base pour la planification des expériences de traitement ultérieures.
### Imagerie Ultrasonore et Évaluation de la Biodistribution
L’efficacité des microbulles Emo@KP à améliorer l’imagerie ultrasonore in vivo a été évaluée à l’aide d’un système d’échographie clinique (VINNO70). Comme le montre la Figure 5A, aucun signal d’écho n’a été observé sur le rein malade avant l’injection des microbulles Emo@KP. Cependant, un signal CEUS (Contrast-Enhanced Ultrasound) évident a été détecté sur le rein malade 10 secondes après l’injection des microbulles emo@KP, indiquant que les microbulles ciblées ont circulé dans les vaisseaux sanguins rénaux et ont permis d’améliorer l’imagerie CEUS. Le signal de contraste est resté très visible jusqu’à 5 minutes après l’injection. De plus, les microbulles Emo@KP préparées peuvent clairement indiquer la zone viable du rein malade, offrant un meilleur effet diagnostique que l’échographie bidimensionnelle.
### Modifications des Indices Sanguins
Comparativement au groupe Sham (témoin), les niveaux de créatinine (CREA) et d’urée (UREA) dans le groupe UUO + Contrôle ont augmenté de manière significative. Ceci pourrait être dû au fait que le réflexe compensatoire du rein non obstrué n’est pas suffisant pour compenser le dysfonctionnement causé par le rein obstrué. Par rapport au groupe UUO + Contrôle, les niveaux de CREA et d’UREA dans les groupes UUO + Emo@P MBs/US et UUO + Emo@KP MBs/US ont diminué, la diminution étant plus significative dans le groupe UUO + Emo@KP MBs/US. Ceci est attribuable non seulement à l’effet UTMD (Ultrasound-Targeted Microbubble Destruction) mais aussi au ciblage spécifique de αKIM-1 (Figure 5D et E).
Comparativement au groupe Sham, les niveaux d’expression des cytokines inflammatoires IL-1β et TNF-α dans le plasma des souris du groupe UUO + Contrôle ont augmenté de manière significative. Cependant, lorsque les microbulles Emo@P et Emo@KP ont été combinées à l’échographie, les niveaux de cytokines inflammatoires se sont progressivement normalisés.Cet effet est plus prononcé dans le groupe Emo@KP MBs/US, ce qui devrait également être dû au ciblage spécifique de αKIM-1 (Figure 5F et G).
Le poids corporel est également un indicateur important de la santé. Après le traitement, le poids des souris de chaque groupe a été mesuré. Les résultats ont montré que le poids des souris du groupe UUO + Contrôle était inférieur à celui du groupe sham, et que le poids des souris des groupes UUO + US, UUO + Emo@P MBs et UUO + Emo@KP MBs était similaire à celui du groupe UUO + Contrôle. Ces résultats indiquent une absence quasi totale d’effet thérapeutique dans ces groupes, ce qui explique davantage la stabilité des microbulles préparées. Cependant, bien que le poids corporel des souris des groupes UUO + Emo@P MBs/US et UUO + Emo@KP MBs/US ait été légèrement inférieur à celui du groupe Sham, il était supérieur à celui du groupe UUO + Contrôle. Ces résultats indiquent que les microbulles combinées à l’irradiation ultrasonore peuvent soulager la fonction rénale altérée, réduire l’infiltration de cellules inflammatoires et améliorer l’état de santé des souris (Figure 5H).
### Coloration Pathologique du Tissu Rénal Malade
Lors de la coloration de Masson, une petite quantité de collagène a été trouvée dans les glomérules et l’interstitium du rein dans le groupe Sham. Par rapport au groupe Sham, la quantité de collagène dans le tissu rénal du groupe UUO + Contrôle a augmenté de manière significative, et le collagène s’est distribué de manière diffuse dans les régions glomérulaires et interstitielles du rein. La quantité de collagène dans les zones glomérulaires et interstitielles rénales des souris des groupes UUO + US, UUO + Emo@P MBs et UUO + Emo@KP MBs était similaire à celle du groupe UUO + Contrôle, ce qui indique davantage la stabilité des microbulles préparées. La teneur en collagène du tissu rénal dans les groupes UUO + Emo@ P MBs/US et UUO + emo@KP MBs/US a été significativement diminuée, en particulier dans le groupe UUO + Emo@KP MBs/US, ce qui pourrait être attribué à l’augmentation de la libération d’émodine par UTMD et à l’absorption d’émodine par αKIM-1 (Figure 6B).
### Analyse Immunohistochimique de la Voie de Signalisation TGF-β/Smad
Des études antérieures ont démontré que l’émodine peut inhiber l’activation de la voie de signalisation TGF-β/Smad, réduire l’expression de la protéine α-SMA, augmenter l’expression de la protéine E-cadhérine, inhiber la transformation épithélio-mésenchymateuse des tubules rénaux, retarder la fibrose des tissus rénaux et exercer une fonction protectrice sur le rein. dans cette étude, l’émodine a été encapsulée dans des microbulles porteuses de médicaments et modifiée en surface avec un anticorps αKIM-1 pour former des microbulles Emo@KP. Théoriquement, l’entrée des microbulles Emo@KP dans les souris UUO atteintes de maladies rénales via le ciblage de αKIM-1, et son action par UTMD, peut libérer de l’émodine, réguler négativement la phosphorylation de Smad2/3 induite par TGF-β, réduisant ainsi la régulation positive de αSMA et la régulation négative de la protéine E-cadhérine causées par l’obstruction. Ceci, à son tour, a réduit le dépôt de MEC et amélioré la fibrose mésenchymateuse chez les souris UUO.
L’immunohistochimie des tissus rénaux a révélé une élévation notable de l’expression de TGF-β, Smad2, Smad3 et α-SMA, accompagnée d’une diminution prononcée de l’expression d’E-cadhérine dans le groupe UUO par rapport au groupe Sham. Ces résultats indiquent que la voie TGF-β/Smad est activée pendant le processus de fibrose rénale consécutive à l’UUO.Les niveaux de TGF-β, Smad2, Smad3, α-SMA et E-cadhérine dans le groupe UUO + US, le groupe UUO + Emo@P MBs et le groupe UUO + Emo@KP MBs étaient similaires à ceux du groupe UUO + Contrôle, ce qui indique davantage la stabilité des microbulles préparées. En comparaison avec le groupe UUO + Contrôle,le groupe UUO + Emo@P MBs/US a démontré une régulation négative de α-SMA,TGF-β,Smad2 et Smad3,accompagnée d’une régulation positive d’E-cadhérine. Ceci suggère que les microbulles Emo@P en présence d’UTMD peuvent être capables d’améliorer l’expression de la FRI par le biais de la voie classique TGF-β1/Smad. Le traitement UUO + Emo@KP MBs/US a entraîné une diminution supplémentaire de l’expression de α-SMA, TGF-β, Smad2 et Smad3, et une augmentation supplémentaire de l’expression d’E-cadhérine, ce qui peut être attribué à l’effet de ciblage de αKIM-1 (Figure 6C–G).
Les auteurs remercient sincèrement le soutien financier du Projet d’Innovation scientifique et Technologique de l’Académie Chinoise des Sciences Médicales Chinoises (CI2021A03309).
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.
« Obstructive Kidney Disease. »
Stevens S
« Unilateral ureteral obstruction as a model to investigate fibrosis-attenuating treatments. »
Martínez-Klimova E,Aparicio-Trejo OE,tapia E,Pedraza-Chaverri J
« Suppression of TRPM2 reduces renal fibrosis and inflammation through blocking TGF-β1-regulated JNK activation. »
Wang Y, Chen L, Wang K, et al
« TGF-β in developmental and fibrogenic EMTs. »
Lee JH, Massagué J
« mechanisms of renal fibrosis. »
Humphreys BD
Les résultats des analyses in vitro et in vivo ont démontré que les microbulles Emo@KP présentaient une bonne biocompatibilité. Le 10e jour, les souris ont été euthanasiées et les principaux organes ont été prélevés pour une analyse histopathologique. Aucune lésion pathologique significative n’a été détectée au niveau histologique (figure 3O).La liste de références suivante concerne divers aspects de la recherche médicale, notamment la fibrose rénale, les macrophages, les cellules immunitaires et les voies de signalisation impliquées dans les maladies rénales. Les sujets abordés incluent les caractéristiques transcriptionnelles des macrophages activés [[6]], le rôle des cellules immunitaires et de l’inflammation dans la progression de l’insuffisance rénale aiguë vers l’insuffisance rénale chronique [[7]], et une vue d’ensemble de la maladie rénale chronique [[8]].
D’autres références mettent en lumière le rôle des cellules épithéliales tubulaires rénales dans la fibrose tubulo-interstitielle [[9]], l’implication de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et du TGF-β dans la fibrose rénale [[10, 11]], et une comparaison internationale de la prévalence de la maladie rénale chronique et du risque d’ESRD [[12]]. La dimension globale et les perspectives de la maladie rénale chronique sont également abordées [[13]].
Certaines études se concentrent sur des mécanismes spécifiques,tels que l’hypertension sensible au sel après l’inversion de l’obstruction urétérale unilatérale [[14]], l’atténuation de l’inflammation et de la fibrose induites par l’obstruction urétérale unilatérale par la noscapine via la régulation des voies de signalisation TGFβ1/Smads [[15]], et le rôle du TGF-β en tant que régulateur principal de la fibrose [[16]]. Les stratégies thérapeutiques et d’administration des constituants phytochimiques pour la fibrose rénale sont également explorées [[17]].
Plusieurs références examinent l’efficacité du rhubarbe contre la fibrose interstitielle rénale [[18]],l’induction de la mort cellulaire autophagique par l’émodine dans la fibrose rénale [[19]], et l’amélioration de la fibrose rénale par l’aloès-émodine via l’inhibition de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR [[20]]. Les activités antifibrotiques in vitro de composés et d’herbes à base de plantes sont également étudiées [[21]].
D’autres études se penchent sur des aspects spécifiques de l’émodine, tels que son inhibition de la NADPH-quinone réductase et sa cytotoxicité dans les hépatocytes de rat [[22]], ainsi que son métabolisme et sa toxicité, révélant que le facteur nucléaire hépatocyte 4α régule l’UGT2B7 et la glucuronidation de l’émodine [[23]].
Enfin, certaines références mettent en évidence le rôle de KIM-1 dans la réduction des lésions rénales aiguës [[24]], en tant que biomarqueur des lésions des tubules proximaux rénaux humains [[25]], et sa médiation des lésions tubulaires dépendantes de la cible mammalienne de la rapamycine dans un modèle de substitution [[26]].Les vésicules extracellulaires ciblées par Kim-1 sont présentées comme une nouvelle plateforme thérapeutique pour l’ARNi dans le traitement de l’AKI [[27]]. La délivrance moléculaire à haute efficacité avec des rafales de sonoporation séquentielles à faible énergie est également explorée [[28]]. Le TGF-β est présenté comme un moteur de la fibrose.[[29]].
Voici les réponses aux questions basées sur le texte fourni :
1. Quel est le problème de santé principalement abordé dans ce texte ?
Le texte traite principalement de la maladie rénale chronique (MRC), en particulier son développement suite à une obstruction urétérale, et notamment l’ obstruction de l’uretère causée par des calculs ou des tumeurs. Il met l’accent sur la fibrose rénale interstitielle (FRI) comme une caractéristique pathologique clé de la MRC.
2. Quelle est la cause la plus courante d’hydronéphrose selon le texte ?
L’obstruction de l’uretère causée par des calculs ou des tumeurs est une cause fréquente d’hydronéphrose.
3. Quel est le modèle animal couramment utilisé pour étudier la fibrose rénale interstitielle (FRI) et comment est-il induit ?
Le modèle animal couramment utilisé est l’obstruction unilatérale de l’uretère (UUO). Il est induit par la ligature de l’uretère gauche, qui est la méthodologie la plus répandue.
4. Quels sont les événements qui se produisent dans le rein après une obstruction urétérale ?
Le rein subit plusieurs événements importants, notamment :
Étirements mécaniques
Activation du système rénine-angiotensine-aldostérone
Perte de cellules épithéliales rénales
Infiltration de macrophages
Inflammation
Stress oxydatif
Activation des fibroblastes
5. Quelle est l’importance de l’émodine dans le contexte du traitement de la MRC et de la FRI ?
L’émodine est une substance issue de la médecine traditionnelle chinoise (MTC). Elle constitue une stratégie pour la FRI. Il a été démontré qu’elle :
Réduit la prolifération et le métabolisme des cellules épithéliales tubulaires rénales.
inhibe la prolifération et la division des fibroblastes rénaux.
Favorise l’apoptose des fibroblastes rénaux.
Réduit l’infiltration de cellules inflammatoires dans les reins endommagés.
Atténue la FRI en inhibant le TGF-β1.
6. Quels sont les inconvénients de l’émodine mentionnés dans le texte ?
Les inconvénients de l’émodine sont :
Effets secondaires toxiques potentiels, notamment une cytotoxicité hépatique.
Faible solubilité dans l’eau, ce qui limite sa biodisponibilité.
7. Quels sont les principaux réactifs expérimentaux utilisés dans l’étude ?
les principaux réactifs expérimentaux sont :
DSPC,DSPE-PEG2000,DSPE-PEG2000-NHS,DSPE-PEG2000-Cy5.5
Émodine
In Vivo MAb anti-souris KIM-1 (αKIM-1)
Kits de test pour créatinine, azote uréique sanguin, transaminases (ALT et AST)
kits de test de viabilité/cytotoxicité
Kits ELISA TNF-α et IL-1β
8. Comment les Emo@KP MBs sont-elles préparées ?
La préparation des Emo@KP MBs implique plusieurs étapes :
Préparation des NPs (nanoparticules) lipidiques (DSPC, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS) combinées à l’émodine.
Conjugaison des nanoparticules avec l’anticorps αKIM-1 pour cibler les cellules rénales.
Encapsulation du mélange dans des microbulles remplies d’hexafluorure de soufre (SF6).
9. Comment est déterminé le rapport d’alimentation optimal de αKIM-1 ?
Le rapport d’alimentation optimal de αKIM-1 est déterminé en évaluant le taux de connexion de αKIM-1 et la taille des microbulles.
10.Comment est évaluée la stabilité du chargement du médicament des Emo@KP MBs ?
Elle est évaluée en stockant les microbulles à 37°C et 4°C, et en mesurant la quantité d’émodine restant dans les microbulles après des intervalles de temps définis. Le taux de fuite est alors calculé.
11. quelles analyses sont utilisées pour étudier les effets des Emo@KP MBs ?
Plusieurs analyses sont utilisées :
Spectroscopie UV-VIS-NIR : pour déterminer la quantité d’émodine.
Microscopie électronique à transmission (MET) : pour caractériser les nanoparticles (nps).
Coloration HE et Masson : pour l’analyze histologique des reins.
Coloration immunohistochimique.
Mesure de l’ALT, AST, CREA et UREA