Dépistage rapide des variants du SRAS-CoV-2, un outil clé pour la surveillance de la pandémie

Réglage et conception

Cette étude observationnelle a été menée à l’hôpital universitaire 12 de Octubre (Madrid, Espagne), qui est un hôpital de référence tertiaire pour l’analyse des variantes du SRAS-CoV-2. L’étude a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki, telle que révisée en 2013. L’approbation d’un comité d’éthique de la recherche n’était pas requise, comme indiqué dans la loi organique 3/2018, promulguée le 5 décembre, concernant la protection des données et la garantie du numérique. Droits. Cette loi permet aux autorités sanitaires et aux établissements publics dotés de pouvoirs de surveillance de la santé publique de mener des recherches scientifiques sans le consentement de la personne concernée dans des situations présentant une pertinence et une gravité exceptionnelles pour la santé publique.

En 2021, une analyse des variantes du SARS-CoV-2 a été menée de manière prospective sur la majorité des échantillons positifs initiaux, en fonction du nombre d’échantillons positifs obtenus lors des vagues de pointe et de la disponibilité des réactifs. Le dépistage des variantes a été effectué sur des échantillons prélevés dans les services d’urgence, les travailleurs de la santé, les hospitalisations et trois centres de soins primaires désignés comme sites sentinelles par les autorités locales de santé publique, couvrant un total de 22 semaines (1–11, 28–37 et 50–52 ). Pendant les 30 semaines restantes (semaines 12 à 27 et 38 à 49), un dépistage des variantes a été effectué sur tous les échantillons initiaux positifs.

Procédures d’étude

L’analyse des variants du SARS-CoV-2 par RT-PCR a été réalisée à l’aide de divers tests de diagnostic en fonction de leur disponibilité et de leur utilité pour détecter les variants émergents. Les réactifs utilisés tout au long de l’étude sont décrits dans le tableau 1.

Les résultats ont été interprétés comme suit : variant Alpha (abandon du gène S ou positif pour N501Y et del H69/V70) ; Bêta/Gamma (positif pour N501Y et E484K) ; Delta (positif pour L452R); et Omicron (positif pour N501Y, del H69/V70 et K417N).

Le séquençage du génome entier (WGS), considéré comme la technique de référence, a été effectué sur des échantillons qui avaient été précédemment analysés pour la variante par RT-PCR et avaient une valeur Ct <25. La décision d'effectuer le WGS dépendait également du nombre d'échantillons positifs obtenus. pendant les vagues de pointe et la disponibilité des réactifs. En conséquence, WGS a été conduit sur 10,8% des échantillons qui ont subi l'analyse de la variante SARS-CoV-2 par RT-PCR. De plus, lorsqu'il n'était pas possible d'effectuer le WGS sur tous les échantillons préalablement analysés par RT-PCR (pendant les vagues de pointe), la sélection des échantillons pour le WGS était basée sur des critères aléatoires. Ce processus de sélection a assuré la représentation d'un ensemble diversifié d'échantillons. Le WGS a été réalisé à partir de l'échantillon d'origine avec des plateformes Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ou avec ABL SA Group (Luxembourg/Illumina, San Diego, CA, USA), en fonction de la disponibilité des réactifs (tableau 1). Les deux méthodes ont suivi le protocole de séquençage ARTIC nCoV-2019⁷. Plus précisément, pour la plate-forme Ion Torrent, l’appel de base, le découpage et le contrôle de la qualité ont été effectués à l’aide du pipeline intégré dans le logiciel Ion Reporter™. Les lectures ont ensuite été cartographiées par rapport au génome de référence Wuhan-Hu-1 (numéro d’accès GenBank : MN908947.3) à l’aide de l’assembleur IRMA⁸ plugin du logiciel Ion Reporter™ (ThermoFisher Scientic, Carlsbad, CA, USA). L’appel de variantes a été effectué en parallèle avec le plugin Variant Caller du logiciel Ion Reporter™ et avec Snippy v.4.6.0⁹, avec les paramètres par défaut (10 fois la couverture minimale et 90 % de fréquence allélique minimale). Les annotations des variants étaient basées sur le génome de référence. Le plugin Variant Caller a également été utilisé pour rechercher des variantes mineures. Pour les filtrer, les lectures ont été cartographiées sur la souche de référence à l’aide du logiciel Geneious Prime (version 2020.0.4, Biomatters Ltd., Nouvelle-Zélande), et les variantes ont été vérifiées manuellement sur les alignements. Toutes les variantes à faible couverture, présentes dans moins de 15% des lectures, situées près des extrémités des lectures (amplicons) ou avec de faibles qualités de lecture ont été écartées. Les variantes identifiées comme problématiques par De Maio et al.^dix ont également été écartés. Pour la plateforme ABL, différentes étapes du pipeline ont été réalisées à l’aide du logiciel MicrobioChek (Groupe ABL SA, Luxembourg)¹¹. Les lignées ont été attribuées selon le schéma PANGO¹² et en utilisant l’application Web Pangolin 2.0¹³et le schéma de lettres d’année NextStrain sur la page Web NextClade¹⁴. Toutes les séquences du SARS-CoV-2 ont été déposées dans la base de données GISAID¹⁵ (code : h-CoV-19/Espagne/MD-H12O).

analyses statistiques

Les variables qualitatives sont présentées sous forme de nombres et de pourcentages. Les figures ont été créées à l’aide de GraphPad Prism, version 6.