2024-02-22 14:28:26
Animaux
Des souris de type sauvage (BALB/cCrSlc) ont été obtenues auprès du laboratoire Jackson et élevées en interne. Des souris mâles âgées de 8 à 12 semaines et pesant entre 23,0 et 25,0 g ont été incluses dans l’étude. Chaque groupe expérimental était composé de six souris. Le sang veineux périphérique a été collecté dans la solution contenant de l’héparine à l’aide des tubes siphon expérimentaux (concentration finale de 100 unités internationales (UI) / ml, Mochida Pharmaceutical Co., LTD., Tokyo, Japon). Le comité d’éthique de l’université de Kanazawa a approuvé l’étude (AP-184027), et l’étude est menée et rapportée conformément à la législation nationale et aux directives ARRIVE. L’euthanasie par inhalation de dioxyde de carbone a été réalisée après l’expérience en tant que méthode humaine de sacrifice animal.
Irradiation et prélèvement de sang périphérique
L’irradiation ionisante a été fournie à l’aide d’un système générateur de rayons X (MBR-1520R-3 ; Hitachi Power Solutions Co. Ltd., Ibaraki, Japon). Avant l’exposition aux rayons X, des mesures du taux de kerma dans l’air ont été effectuées. Le débit de dose à l’endroit où le sujet est placé et le débit de dose à l’emplacement de surveillance pour la dose accumulée pendant l’irradiation ont été pré-mesurés. La dose administrée au sujet est alors automatiquement calculée en fonction du rapport entre ces deux débits, et l’irradiation est automatiquement arrêtée. Les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane avant le prélèvement sanguin. Le volume de chaque échantillon de sang était de 500 μL.
Expérience d’irradiation externe : in vitro
Pour le FCM, les échantillons de sang veineux périphérique de huit groupes expérimentaux (6 souris/groupe) collectés ont été exposés aux doses d’irradiation suivantes : 0,10, 0,25, 0,75, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75 et 2,00 Gy (tension du tube, 150 Â kV ; courant du tube, 20 mA ; filtre, 0,5 mm Al et 0,2 mm Cu ; distance entre le foyer et la cible, 320 mm). Des échantillons de sang exclus de l’irradiation ont été définis comme contrôles. Pour la coloration immunohistochimique (IHC), un groupe expérimental (3 souris/groupe) a été irradié avec des doses de 1 Gy et un groupe témoin de 3 souris a été défini pour l’observation et les analyses.
Expérience d’irradiation externe : in vivo
Les souris de huit groupes expérimentaux (6 souris/groupe) ont reçu une irradiation du corps entier à des doses de 0,10, 0,25, 0,5, 0,75, 1,00, 1,25, 1,5, 2,00 Gy, respectivement pour chaque point temporel d’observation (tension du tube, 150 kV ; courant du tube, 15 mA ; filtre, 0,5 mm Al et 0,5 mm Cu ; distance entre le foyer et la cible, 400 mm). Lors de l’irradiation, les souris ont été confinées dans une petite cage (en forme d’éventail ; rayon 10 cm, hauteur 4,5 cm, angle 30 °) spécifique à l’irradiation X. Les animaux non irradiés ont servi de témoins. Des échantillons de sang ont été prélevés aux jours 0, 3, 7 et 14 après l’exposition aux radiations.
Irradiation interne
Quatorze souris ont reçu une injection intrapéritonéale d’une solution d’iodure de sodium I-131 (74 MBq) (cinq souris / groupe), et quatre souris ayant reçu une injection de solution saline physiologique pour les accidents vasculaires cérébraux ont été définies comme groupe témoin. Des échantillons de sang ont été prélevés à des moments de 1 h et 24 h par groupe (5 souris/groupe).
La préparation des échantillons
Les échantillons de sang périphérique collectés ont été lysés à l’aide de réactifs de lyse des globules rouges (RBC Lysis Buffer). Chaque échantillon a été divisé en deux aliquotes de 50 μl chacune à une densité de 1 à 106 cellules/50 μl pour la coloration suivante par immunofluorescence des cellules T et B. Les cellules mononucléées du sang périphérique pour la coloration IHC ont été fixées en ajoutant une solution tampon de phosphate de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante après 3 h d’incubation dans des plaques à 12 puits (37 °C, 5 % de CO2).
Coloration par immunofluorescence et évaluation des dommages à l’ADN
Les anticorps monoclonaux (AcM) suivants ont été achetés auprès de BioLegend, BD Bioscience et Abcam : anticorps anti-souris CD8a (clone 53-6.7, PE/Cyanine7 conjugué), anticorps anti-souris CD4 (clone GK1.5, FITC conjugué), anti-souris CD45R/B220. anticorps (clone RA3-6B2, conjugué FITC), anticorps anti-H2AX (pS139) (clone N1-431, conjugué PE) et anticorps anti-gamma H2AX (pS139) (clone EP854(2)Y, Alexa Fluor® 488- conjugué). La coloration de l’antigène de surface cellulaire a été réalisée uniquement pour le FCM. Par la suite, nous avons utilisé une solution de fixation et de perméabilisation pour pénétrer dans la membrane et effectuer une coloration intracytoplasmique à l’aide de l’anticorps anti-H2AX (pS139) susmentionné. L’ensemble de la procédure de coloration a été réalisée conformément aux directives et protocoles du fabricant. Les cellules colorées ont été analysées sur un cytomètre en flux (RF-500, Sysmex Corporation, Kobe, Japon) pour le FCM.
Mesure de la dose absorbée
Mesures de radioactivité (pourcentage de dose injectée [%ID] par gramme) ont été réalisées 1, 3 et 24 h après l’injection à l’aide d’un système gamma à puits automatique (AccuFLEX γ ARC-800, Hitachi Aloka Medical, Ltd., Mitaka, Tokyo) dans l’expérience d’irradiation interne. Toutes les données au cours du lavage de 24 heures ont été utilisées pour tracer une courbe d’exposition au sang avec un ajustement de courbe double exponentielle. Des analyses de régression non linéaire ont été effectuées à l’aide du logiciel MagicPlot Pro (version 2.7.2) pour obtenir des constantes de temps et des coefficients exponentiels. Les volumes sanguins circulants de souris ont été calculés (72 ml/kg). Ensuite, l’activité accumulée dans le sang, le sang, a été dérivée. La dose sanguine a été calculée à l’aide de la formule médicale de dose de rayonnement interne :
$${text{D}}_{{{text{blood}}}} = tilde{A}_{{{text{blood}}}} {text{S}}_{{{ text{sang}} leftarrow {text{sang}}}}$$
où Dblood est la dose moyenne absorbée et Sblood↠sang ((3,18times {10}^{-11} , mathrm{Gy } , {{text{s}}}^{-1} , {{text{Bq}}}^{-1} , {text{ml}})) est le facteur S sang-sang pour l’I-13119.
Analyses de données et statistiques
Toutes les données de cytométrie en flux ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo (version 10.8.1, Becton Dickinson & Company (BD), Franklin Lakes, New Jersey, USA). Tous les résultats sont présentés sous forme d’écart type moyen (ET)/erreur type. L’importance des différences entre les groupes a été évaluée à l’aide de l’analyse unidirectionnelle de la variance et des tests t. L’ajustement linéaire de corrélation radioactive a été effectué sur les résultats des expériences d’irradiation externe et interne. Une valeur P de ≤ < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel JMP Pro (version 16.0.0, SAS Institute, Cary, NC, USA).
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