Culture de cellules
Des cellules mononucléaires de leucémie myéloïde humaine THP-1 et des cellules de type macrophage de souris (RAW264.7) ont été obtenues auprès de la banque de cellules de l’Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Les cellules THP-1 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, USA) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Ausbian, USA) et de 1 % de pénicilline/streptomycine (Solarbio, Chine). Les cellules RAW264.7 ont été cultivées dans du DMEM complet (Gibco, USA) contenant 10% de FBS. La culture a été effectuée à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur à température et humidité constantes.
Culture et infection par le BCG
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) a été acheté auprès du Centre chinois de contrôle et de prévention des maladies (Pékin, Chine). Les cultures ont été cultivées dans un bouillon Middlebrooks 7H9 (Becton Dickinson & Company, USA) contenant 0,5 % de glycérol, 0,05 % de Tween-80 et 10 % d’OADC. Les cultures ont été incubées dans un incubateur à température constante à 37 ° C, et les cellules ont été recueillies par centrifugation lorsque la culture avait atteint la densité appropriée (OD600 = 0,5). Avant l’infection, les cellules THP-1 cultivées jusqu’à la phase logarithmique ont été ensemencées dans des plaques à six puits avec 1 × 106 cellules par puits. Les cellules THP-1 ont été cultivées pendant 24 h dans un milieu contenant 50 ng/mL de PMA (Sigma-Aldrich, USA), qui a été utilisé pour induire la différenciation des monocytes THP-1 en macrophages. Les cellules adhérentes ont ensuite été infectées par le BCG à un MOI de 10.
Construction et transfection de petits ARN interférents DUSP1
Trois petites séquences d’ARN interférent (tableau 1) ont été conçues contre la séquence de la région codante DUSP1 humaine et synthétisées par Genepharma (Shanghai, Chine). Les cellules THP-1 ont été induites dans une plaque à 6 puits à l’aide de PMA, ensemencées à une densité de 1 × 106 cellules par puits avant la transfection avec le petit ARN interférent (siRNA-DUSP1), pour les groupes sans ajout de siRNA-DUSP1, siRNA-NC a été ajouté comme contrôle négatif. Les transfections ont été réalisées à l’aide du réactif Lipofectamine™ RNAi MAX (Invitrogen, USA) selon le protocole du fabricant et l’intensité de fluorescence a été observée par microscopie à fluorescence 24h post-transfection.
Isolement d’ARN et PCR en temps réel
L’ARN total a été extrait des cellules THP-1 à l’aide du kit d’extraction d’ARN total (TIANGEN, Chine) en suivant le protocole du fabricant. Le premier brin a été synthétisé à partir de 1 μg d’ARN total à l’aide du Reverse Transcription System Kit (Takara, Chine) et la RT-qPCR a été réalisée à l’aide de SYBR Premix ExTaq II (Takara, Chine) dans un volume total de 20 μL. Les séquences d’amorces utilisées dans la RT-qPCR sont répertoriées dans le tableau 2. Les niveaux d’expression sont normalisés à GAPDH, chaque test étant effectué en triple exemplaire. Les variations relatives de pli dans l’expression de l’ARN messager ont été calculées à l’aide de la 2-ΔΔCt méthode.
Western blot
La protéine totale a été extraite des cellules THP-1 à l’aide d’un kit d’extraction de protéine totale (KeyGEN BioTECH, Chine), après quoi le lysat cellulaire a été centrifugé à 12 000 tr/min. Le surnageant a ensuite été collecté et la concentration en protéines a été déterminée via un test BCA (ThermoFisher, USA). Les échantillons de protéines ont ensuite été chauffés à 100 ℃ dans un tampon de chargement de protéines 1 × (Transgene, Chine) pendant 5 min et séparés via 10% SDS-PAGE. Les transferts ont ensuite été transférés par voie humide sur des membranes de PVDF, bloqués avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 h à température ambiante et les anticorps phosphorylés ont été bloqués avec du BSA à 3 %. Les échantillons ont ensuite été incubés pendant une nuit après addition d’anticorps de détection au facteur de dilution suivant : DUSP1 (1:1000) ; ERK (1:1000); p-ERK (1:1000); p-NF-κB p65 (1:1000; tous d’Affinity, Chine); Bcl-2 (1:2000); Bax (1:2000); Cytochrome C (1:1000); Apaf-1 (1:1000); Clivée-PARP1 (1:2000); Caspase3 clivée (1:2000); Clivée-caspase9 (1:1000 ; toutes d’Abcam, Royaume-Uni) ; p38 (1:1000); p-p38 (1:1000); JNK (1:1000); p-JNK (1:1000; tous de ABclonal, Chine); et GAPDH (1:2000 ; Abmart, Chine). Les membranes ont ensuite été incubées avec des IgG couplées à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante (1: 5000; Abmart, Chine). Après lavage avec du TBST, des bandes immunoréactives ont été observées à l’aide du kit ECL (Advansta Inc., USA) et scannées pour les bandes de protéines à l’aide d’Amersham ImageQuant 800 (Cytiva, Japon). Enfin, les bandes de protéines ont ensuite été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ.
Détection de l’apoptose par cytométrie en flux
Cellules THP-1 (1 × 106 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, transfectées avec du siRNA-DUSP1, incubées pendant 24 h et infectées avec du BCG (MOI = 10) et incubées pendant encore 6 h. L’apoptose a été détectée par FACS à l’aide d’un kit d’annexine V/iodure de propidium (PI) (KeyGEN BioTECH, Chine). Les cellules ont ensuite été récoltées et lavées deux fois avec du PBS, puis remises en suspension dans 500 μL de tampon de liaison. 5 μL de solution de coloration à l’annexine V et de solution de coloration PI ont été ajoutés à chaque échantillon et incubés pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière. Après centrifugation à 1000 tr/min pendant 5 min, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 500 μL de tampon de liaison et les échantillons ont été analysés à 535 nm (PI) et 488 nm (Annexine V) à l’aide d’un cytomètre FACS Canto™ II (BD, USA).
Détection du potentiel de membrane mitochondriale (MMP) par cytométrie en flux
Cellules THP-1 (1 × 106 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, transfectées avec du siRNA-DUSP1, incubées pendant 24 h, puis infectées avec du BCG (MOI = 10) et incubées pendant encore 6 h. Les changements de MMP ont été analysés avec le kit JC-1 (ThermoFisher Scientific, USA) et FACS. En bref, les cellules de différents groupes ont été récoltées après le traitement. Un groupe témoin positif distinct est également requis. Les cellules du groupe témoin positif ont été traitées avec du CCCP (20 μM) pendant 30 min. Ensuite, les cellules de tous les groupes ont été lavées trois fois avec du PBS, puis remises en suspension dans 500 μL de PBS. Les suspensions cellulaires ont ensuite été colorées avec 200 μM JC-1 (5 μL, concentration finale = 2 μM) à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 30 min. Chaque échantillon a été détecté à 488 nm à l’aide d’un cytomètre FACS Canto™ II (BD, USA). L’analyse a ensuite été réalisée avec le logiciel FlowJo®.
Test d’immunofluorescence
Cellules THP-1 (1 × 105 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits avec des lamelles cellulaires, transfectées avec du siRNA-DUSP1 et cultivées pendant 24 h après la transfection. Les cellules ont été infectées avec du BCG (MOI = 10) et incubées pendant 6 h supplémentaires. Les cellules ont ensuite été lavées 3 fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min. Les cellules ont été lavées et perméabilisées avec du TritonX-100 à 0,5 % pendant 20 min, puis bloquées avec du BSA à 3 % pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps ont été dilués dans 3 % de BSA aux facteurs de dilution de DUSP1 (1 : 200), Cleaved-Caspase3 (1 : 200), Cleaved-PARP1 (1 : 200), p-p38 (1 : 100), p-JNK (1 :100), p-ERK (1:200) et p-NF-κB p65 (1:200). 500 μL de l’anticorps primaire ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant une nuit à 4 °C. Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire couplé à la fluorescéine (1: 1000) dans du PBS pendant 1 h à 37 ° C, à l’abri de la lumière. Enfin, les cellules ont été colorées avec un bloqueur fluorescent contenant du DAPI (ORIGENE, Chine) bloqué, et les images ont été acquises avec un système confocal Leica TCS SP2 A0BS et traitées sur le logiciel confocal Leica (Leica, Allemagne).
Dosage immuno-enzymatique
Les kits ELISA pour IL-1β et TNF-α ont été obtenus auprès de Thrive Biotechnology (Shanghai, Chine). Du sang périphérique a été prélevé sur des souris dans différents groupes de traitement et les niveaux de cytokines inflammatoires TNF-α et IL-1β ont été mesurés par ELISA. Les expériences ont été réalisées selon les instructions du fabricant, et les expériences ont été répétées trois fois et les valeurs moyennes ont été prises.
La microscopie électronique à transmission
Les cellules THP-1 ont été lavées avec du PBS, fixées avec du glutaraldéhyde à 3 %, refixées avec du tétroxyde d’osmium à 1 %, déshydratées étape par étape dans de l’acétone et incorporées à l’aide d’Ep812 (EMCN, Chine). Des coupes ultra-minces ont ensuite été réalisées avec un couteau en diamant, des coupes ont été colorées avec de l’acétate d’uranyle (EMCN, Chine) et du citrate de plomb (EMCN, Chine) et observées par microscopie électronique à transmission JEM-1400FLASH (JEOL, Japon).
Expérimentation animale
Des souris C57BL/6J ont été achetées auprès de Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd. (Chengdu, Chine). Les souris ont été logées dans une pièce spéciale exempte d’agents pathogènes avec de la nourriture et de l’eau à volonté et un cycle lumière-obscurité régulier de 12:12. Trois siARN ciblant DUSP1 de souris (tableau 3) ont été transfectés dans des cellules RAW264.7 à l’aide du réactif Lipofectamine ™ RNAi MAX (Invitrogen, USA) conformément au protocole du fabricant pour rechercher le meilleur siRNA-DUSP1. Des expériences in vivo ont été réalisées à l’aide d’Advanced Transfection Reagent (ZETA, États-Unis) pour interférer avec l’expression pulmonaire de DUSP1 chez des souris C57BL/6J par plusieurs perfusions des voies respiratoires. 24 souris mâles C57BL/6J (âgées de 8 semaines) ont été utilisées pour des expériences in vivo. Il y avait 4 groupes de traitement (6 animaux dans chaque groupe), le groupe siRNA-NC, le groupe siRNA-NC + infection par le BCG, le groupe siRNA-DUSP1 et le groupe siRNA-DUSP1 + BCG. Les souris ont été pesées et enregistrées avant le traitement médicamenteux. Le BCG a été dilué à 2 × 106 CFU/100 µL de suspension en utilisant une solution saline. siRNA-DUSP1 a été préparé à 1 OD/50 µL en utilisant de l’eau sans nucléase, siRNA-DUSP1 a été préparé à 20 µg/100 µL de solution de travail en utilisant une solution saline, et une solution saline seule a été utilisée comme contrôle négatif (100 µL). Une suspension diluée de BCG ou une solution saline a été instillée par voie intranasale dans les voies respiratoires des souris anesthésiées à l’isoflurane à l’aide d’une pipette de 100 µL comme décrit précédemment46. La solution de travail siRNA-DUSP1 a été administrée de la même manière un jour après l’infection par le BCG, et les souris ont été traitées tous les 6 jours. Les souris ont été sacrifiées au jour 21 et les concentrations de TNF-α et d’IL-1β dans le sang périphérique ont été déterminées au moment terminal en utilisant ELISA. Les tissus pulmonaires ont été prélevés, fixés et colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) comme décrit précédemment, avant d’effectuer une analyse immunohistochimique, l’imagerie des coupes à l’aide d’un système de caméra microscopique et le calcul du pourcentage de zone positive par image à l’aide du système d’analyse de données Halo .
Déclaration d’éthique
Toutes les expérimentations animales étaient conformes aux directives ARRIVE et ont été réalisées conformément aux directives des National Institutes of Health des États-Unis pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire (NI Publications n ° 85-23, révisées en 1985) et à l’utilisation des animaux de laboratoire et à la législation chinoise sur les animaux de laboratoire. Animaux. Le protocole d’expérimentation animale dans cette étude était conforme aux règles de gestion des animaux du ministère chinois de la santé (document n° 55, 2001) et a été approuvé par le comité d’éthique de la recherche du comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux du comité d’éthique du Sichuan Lilaisinuo ( Licence expérimentale : LLSN-2022002).
analyses statistiques
Les tests statistiques ont été effectués avec GraphPad Prism v8.0 (GraphPad Software, USA). Tous les résultats ont été décrits comme moyenne ± SD et ont été dérivés de 3 répétitions biologiques. La différence entre les 2 groupes a été comparée par ANOVA à un facteur.
