Emploi d’un test fonctionnel à haut débit pour définir les facteurs critiques qui influencent les anticorps neutralisants à variantes croisées induits par le vaccin pour le SRAS-CoV-2

Conception de l’étude, déclaration éthique et prélèvement d’échantillons

Les participants vaccinés ont été recrutés dans le cadre de l’étude COVID-19 PROTECT (2012/00917). Les échantillons de plasma de convalescence ont été collectés auprès de sujets chez lesquels un diagnostic de COVID-19 a été posé par des résultats positifs de réaction en chaîne par polymérase (PCR) (étude 2020/00120). Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit conformément à la Déclaration d’Helsinki pour la recherche humaine. Le comité d’éthique du Domain Specific Review Board (DSRB) de Singapour du National Healthcare Group (NHG) a donné son approbation éthique pour ce travail.

Tous les participants vaccinés ont reçu deux doses du vaccin à ARNm Pfizer/BioNTech BNT162b2 à 21 jours d’intervalle. Quatre échantillons de plasma ont été prélevés sur chaque participant : le jour de la première dose, avant la vaccination (c’est-à-dire avant la vaccination) ; le jour de la deuxième dose, avant la vaccination (c’est-à-dire après la première dose) ; 3 mois après la première dose (c’est-à-dire réponse maximale) ; et 6 mois après la première dose. De plus, des échantillons de plasma à un cinquième moment, 1 à 3 mois après la dose de rappel (c’est-à-dire la troisième dose), ont été prélevés auprès de 27 personnes. Pour analyser la réponse à la vaccination dans la population générale, les participants ayant des antécédents connus d’infection par le SRAS-CoV-2 et les participants sous traitements immunosuppresseurs ont été exclus. Au total, 699 échantillons de plasma provenant de 168 participants ont été inclus dans cette étude.

Dix échantillons de plasma de convalescence ont été prélevés 1 à 3 mois après le diagnostic. Tous les volontaires convalescents s’étaient rétablis avant le prélèvement des échantillons.

Expression et purification des antigènes et récepteurs du SRAS-CoV-2

SARS-CoV-2 Spike hexapro, RBD et ACE2 ont été purifiés comme décrit ailleurs³⁹. Les variantes de RBD ont été produites en utilisant RBD comme modèle et mélange d’enzymes KLD (NEB) et exprimées et purifiées en utilisant la même méthode que pour RBD. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 5.

Le gène codant pour la nucléocapside du SRAS-CoV-2 (Biobasic) a été cloné dans Pnic28, exprimé dans BL21 (DE3) et purifié à partir de la fraction soluble à l’aide de sa résine de purification d’étiquette cOmplete™ (Roche).

ELISA quantitatif de liaison aux variantes ELISA/RBD

Les antigènes ont été dilués dans du PBS 1 × et déposés sur des immunoplaques maxi-reliure à fond plat de 96 puits (SPL Life Sciences # 32296) en incubant à 4 ° C pendant la nuit. La plaque a été lavée trois fois avec un tampon de lavage (PBS 1 × avec 0, 05% de Tween-20) et bloquée avec un tampon de blocage (albumine sérique bovine à 3% dans un tampon de lavage) pendant 60 minutes d’incubation. Les échantillons de plasma ont été dilués 200 fois et 5 000 fois dans un tampon de blocage et ajoutés aux plaques. Pour estimer les concentrations d’anticorps anti-spike et anti-RBD, un anticorps IgG monoclonal humain spécifique du RBD nommé LSI-COVA-015 isolé d’un patient convalescent COVID-19 a été dilué à une série de concentrations allant de 1 ng/mL à 1 µg. /mL et ajouté. De même, un anticorps IgG monoclonal spécifique de la nucléocapside nommé LSI-COVANC-D généré à partir du clonage d’hybridomes^40,41 a été ajouté aux mêmes concentrations pour estimer la concentration d’anticorps anti-nucléocapside dans les échantillons de plasma. Après 60 minutes d’incubation, la plaque a été lavée et incubée avec des anticorps IgG-HRP anti-humains de chèvre (Invitrogen #31413, dilués 10 000 fois dans un tampon de blocage) pendant 50 minutes, à l’abri de la lumière. L’étape de lavage des plaques a été répétée et un substrat TMB (Thermo Scientific #34029) a été ajouté. Après 3 minutes d’incubation, la réaction a été arrêtée avec 1 MH₂DONC₄ et densité optique à 450 nm (OD₄₅₀) ont été enregistré. Des courbes standard ont été construites en utilisant les anticorps de référence de 100 à 1 ng/mL, et la concentration d’anticorps IgG spécifiques de l’antigène dans les échantillons de plasma a été calculée par interpolation.

Pour le test ELISA de liaison au variant RBD, des échantillons de plasma ont été testés à une dilution de 100 fois. Un contrôle négatif (FBS dilué 100 fois inactivé par la chaleur) et un contrôle positif (ACE2-Fc à 5 µg/mL dans le contrôle négatif) ont été inclus pour chaque variante dans chaque plaque.

Production de lentivirus pseudotypés SARS-CoV-2

La méthodologie de transfection inverse a été utilisée pour générer des particules virales pseudotypées exprimant les protéines SARS-CoV-2 Spike, à l’aide d’un système lentivirus de troisième génération. Un total de 36 × 10⁶ Les cellules HEK293T ont été transfectées avec 27 µg de pMDLg/Prre (Addgene, #12251), 13,5 µg de Prsv-Rev (Addgene, #12253), 27 µg de Ptt5LnX-WHCoV-St19 (SARS-CoV-2 Spike) et 54 µg de Phiv-Luc. -ZsGreen (Addgene, #39196) utilisant le réactif de transfection Lipofectamine 3000 (Invitrogen, #L3000-150) et cultivé à 37 °C, 5 % de CO₂ incubateur pendant trois jours. Au jour 4, le surnageant viral a été collecté et filtré à travers une unité filtrante de 0,45 µm (Merck). Le surnageant filtré du pseudovirus a été concentré en utilisant 40 % de PEG 6000 par centrifugation à 1 600 °C.g pendant 60 minutes à 4 °C. Le kit de titre rapide Lenti-X p24 (Takara Bio, # 632200) a été utilisé pour quantifier les titres viraux, conformément au protocole du fabricant.

Test de neutralisation des pseudovirus (PVNT)

Des cellules CHO exprimées de manière stable par ACE2 ont été ensemencées à une densité de 5 × 10⁴ cellules dans 100 µL de milieu complet [DMEM/high glucose with sodium pyruvate (Gibco, #10569010), supplemented with 10% FBS (Hyclone, #SV301160.03), 10% MEM Non-essential amino acids (Gibco, #1110050), 10% geneticin (Gibco, #10131035) and 10% pencillin/streptomycin (Gibco, #15400054)], dans des plaques blanches à fond plat et transparent de 96 puits (Corning, # 353377). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C avec une atmosphère humidifiée à 5% de CO₂ pendant 24h. Le lendemain, les échantillons de plasma du sujet ont été dilués à un facteur de dilution final de 80 avec du PBS 1 × stérile. Les échantillons dilués ont ensuite été incubés avec un volume égal de pseudovirus à une concentration de 2 × 10⁶ IFU/mL pour atteindre un volume total de 50 µL, à 37 °C pendant 1 h. Le mélange pseudovirus-plasma a été ajouté aux cellules monocouches CHO-ACE2 et laissé incubé pendant 1 heure pour permettre une infection virale pseudotypée. Ensuite, 150 µL de milieu complet ont été ajoutés à chaque puits pour une incubation supplémentaire de 48 h. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS stérile. 100 µL de réactif de test de luciférase ONE-glo™ EX (Promega, #E8130) ont été ajoutés à chaque puits et les valeurs de luminescence ont été lues sur le Tecan Spark 100 M. Le pourcentage de neutralisation a été calculé comme suit :

Valeurs IC50 dérivées du PVNT (UI/Ml) à l’aide de la norme internationale étalonnée de l’immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 de l’OMS

Les valeurs ID50 (facteur de dilution inhibiteur à 50 % de neutralisation) obtenues à partir du PVNT ont été converties en valeurs IC50 (concentration inhibitrice à 50 % de neutralisation), en utilisant la norme internationale de l’OMS pour l’immunoglobuline anti-SARS-CoV-2 (20/136). Le test PVNT a été réalisé comme décrit ci-dessus. Le mélange de pseudovirus a été incubé avec huit dilutions en série quintuples de la norme internationale (dilution de départ au 1:100). Les valeurs ont ensuite été tracées et ID50 a été déterminée. Conformément au protocole de l’OMS, 20/136 se sont vu attribuer une valeur arbitraire de 250 UI/ampoule (1 000 UI/mL) pour l’activité neutralisante. Un facteur d’étalonnage a été dérivé sur la base de l’ID50 converti en UI/mL (1 000/ID50). Par la suite, les valeurs ID50 ont été obtenues de la même manière à partir de neuf échantillons de vaccinés et de trois échantillons de plasma regroupés du panel de référence de l’OMS (20/150, 20/148, 20/140) incubés avec trois dilutions en série au quintuple (dilution initiale au 1:100). Les valeurs ID50 ont ensuite été converties en IC50 (UI/mL) en multipliant le facteur d’étalonnage.

ELISA de liaison aux variantes RBD

La capacité de liaison des échantillons de plasma aux variantes RBD a été testée à l’aide d’un protocole ELISA similaire à celui décrit précédemment. Les variantes de RBD ont été recouvertes à 1 µg/mL et les échantillons de plasma ont été testés à une dilution de 100 fois. Un contrôle négatif (FBS dilué 100 fois inactivé par la chaleur) et un contrôle positif (ACE2-Fc à 5 µg/mL dans le contrôle négatif) ont été inclus pour chaque variante dans chaque plaque. DO signalée₄₅₀ a été calculé en soustrayant la DO de fond₄₅₀ de plasma dilué se liant au tampon de blocage de la DO₄₅₀ de plasma dilué se liant aux variantes RBD.

ELISA d’inhibition de la liaison ACE2-RBD

La capacité des échantillons de plasma à inhiber l’interaction de liaison entre les variantes ACE2 et RBD a été évaluée à l’aide d’un protocole similaire à l’ELISA de liaison des variantes RBD. Wuhan-Hu-1, Alpha, Beta, Gamma et Delta RBD ont été enduits à 1 µg/mL. Wuhan-Hu-1 RBD et Omicron RBD ont été enduits à 2 µg/mL. Les Wuhan-Hu-1 RBD ont été enduits à deux concentrations pour l’étalonnage des résultats d’Omicron RBD afin de tenir compte de la différence dans les concentrations de revêtement. Les échantillons de plasma ont été testés à une dilution de 5 fois et l’anticorps secondaire utilisé était l’ACE2-Peroxydase (conjugué à l’aide du kit de marquage à la peroxydase-NH₂, Abnova #KA0014), à 600 ng/mL pour Omicron, ou 300 ng/mL pour toutes les autres variantes de RBD. Un contrôle négatif (FBS dilué 5 fois inactivé par la chaleur) et un contrôle positif (ACE2-Fc à 100 µg/mL dans le contrôle négatif) ont été inclus pour chaque variante dans chaque plaque. Le % d’inhibition a été calculé à l’aide de la formule suivante :

Cinétique d’interaction

La cinétique de liaison entre le récepteur ACE2 humain et le SARS-CoV-2 RBD a été mesurée à l’aide de l’Attana Cell 200 (Attana AB), qui utilise la technologie de microbalance à cristaux de quartz. Une chimie de couplage d’amine standard a été utilisée pour immobiliser le Wuhan-Hu-1 RBD ou l’Omicron RBD sur des puces de capteur LNB-carboxyle. Les puces ont été stabilisées à un débit de 20 µL/min à 22 °C en utilisant du HBST comme tampon de fonctionnement. Des injections en triple ont été réalisées avec de l’ACE2-Fc humain à cinq concentrations, suivies d’une régénération avec 10 Mm de Glycine (Ph 2).

Pour examiner l’inhibition de cette interaction par les anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2, une deuxième expérience a été réalisée à l’aide d’une nouvelle puce LNB-carboxyle immobilisée comme précédemment avec Wuhan-Hu-1 RBD. Des injections en triple ont été effectuées, dans un ordre randomisé, sur la surface stabilisée en utilisant du plasma humain pré-vaccinal dilué 20 fois, seul ou enrichi de 1,67 × 10^–8 M anticorps neutralisant COVA2-39³¹; 1,67 × 10^–8 Anticorps non neutralisant M, LSI-COVA-15 ; ou un étalon de diagnostic de l’OMS dilué 20 fois (plasma de convalescence regroupé). Après chaque injection 2,6 × 10^-7 M ACE2 a ensuite été injecté sur la surface et laissé se dissocier avant la régénération, comme décrit précédemment.

Un bruit négligeable (< 3 Hz) a été détecté sur le canal de référence. L'ajustement des courbes et l'analyse des données ont été effectués à l'aide du logiciel TraceDrawer.

analyses statistiques

Les données démographiques continues ont été présentées sous forme de médiane avec intervalle interquartile (IQR), tandis que les données démographiques catégorielles et les informations sur les antécédents médicaux ont été présentées sous forme de nombre absolu avec proportion (%). La régression linéaire multiple a été utilisée pour évaluer l’effet des informations démographiques (âge, sexe, origine ethnique, IMC) et des antécédents médicaux (tabagisme, hypertension, taux de cholestérol élevé) sur les concentrations d’IgG spécifiques de l’antigène SARS-CoV-2 et les niveaux d’anticorps neutralisants, respectivement. . Les niveaux d’anticorps neutralisants et les concentrations d’IgG spécifiques à l’antigène à différents moments ont été évalués à l’aide du test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn pour corriger les comparaisons multiples. L’association entre le % de neutralisation du PVNT et le % d’inhibition de l’ELISA d’inhibition de la liaison ACE2-RBD a été modélisée à l’aide d’une régression linéaire simple, et le coefficient de corrélation de Pearson a également été rapporté. Les données de liaison et les données d’inhibition de l’ACE2 sur les variantes de RBD ont été comparées aux souches originales de Wuhan-Hu-1 à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn. Les résultats sur la souche Wuhan-Hu-1 et d’autres variantes de RBD ont été comparés à l’Omicron RBD à l’aide du test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux, le cas échéant. Toutes les expériences ont été réalisées avec trois répétitions techniques. La moyenne et l’erreur standard de la moyenne (SEM) sont indiquées dans tous les graphiques, sauf indication contraire. Toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de Graphpad Prism 9.0 et peuvent être consultées dans les données supplémentaires.