Instruments et réactifs
Les instruments utilisés étaient la chromatographie liquide haute performance (HPLC) LC-20 C (Simadzu, Japon), le spectromètre de masse triple quadripôle API4000+ (Applied Biosystem, USA), le mélangeur vortex (XW-80 A, Shanghai Medical Instrument Factory Co., Ltd., Chine), une centrifugeuse (ABBOTT, Allemagne), une balance analytique électronique (CPA225D, Sartorius, Allemagne), un réfrigérateur basse température (MDF-U2086S, Sanyo, Japon) et une armoire réfrigérée (YC-180, Aucma, Chine).
Les réactifs utilisés étaient une substance de référence de sulfate de colistine (Contenu : 95,1 %, lot n° : 833621, Dr. Ehrenstorfer GmbH, Allemagne) ; sulfate de colistine (Contenu : ≥95 %, numéro de lot : P037-01BL, TOKU-E, USA) ; plasma humain (Hebei Blood Center, Chine) ; acide méthanoïque (chromatographiquement pur, Shanghai Aladdin, Chine) ; acétonitrile (chromatographiquement pur, Fisher, USA); et de l’eau distillée.
Préparation de la solution
La substance de référence du sulfate de colistine (20 mg) a été mesurée avec précision et placée dans une fiole jaugée de 10 ml, dissoute et diluée avec une solution de méthanol à 20 % jusqu’à volume constant pour obtenir la solution mère de sulfate de colistine avec une concentration massique de 2 mg. ·mL− 1. La solution mère a ensuite été diluée avec une solution de méthanol à 20 % par gradients pour obtenir les solutions de référence de sulfate de colistine avec des concentrations massiques de 0,5 µg·mL− 1, 2. µg·mL− 1 et 5 µg·mL− 1. De plus, une quantité appropriée de la solution mère a été transférée et ajoutée avec du plasma blanc pour préparer des échantillons de plasma de contrôle qualité de sulfate de colistine, avec des concentrations massiques de 0,5 µg·mL− 1. , 2 µg·mL− 1 et 5 µg·mL− 1, et ces échantillons ont été conservés dans un réfrigérateur à 4 °C.
La substance de référence du sulfate de colistine (20 mg) a été pesée avec précision dans une fiole jaugée de 10 ml, dissoute et diluée avec une solution de méthanol à 20 % jusqu’à volume constant pour obtenir la solution mère de sulfate de colistine, avec une concentration massique de 2 mg·mL. − 1. La solution mère a été diluée avec une solution de méthanol à 20 % par gradients jusqu’à des solutions de travail étalons internes avec une concentration massique de 40 µg·mL− 1, et les solutions ont été stockées dans un environnement à 4 °C. réfrigérateur.
Prétraitement des échantillons de plasma
Transférer 200 µL d’échantillon de plasma de contrôle qualité dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Ajouter 20 µL de sulfate de colistine étalon interne (40 µg·mL-1) et 400 µL de solution de méthanol-acide trichloroacétique à 5 % (50 :50, V/V). Mélanger pendant 2 min sur un mélangeur vortex, centrifuger à 10 900 r·min-1 pendant 5 min, puis transférer 200 µL du surnageant dans un flacon d’échantillon pour mesure.
Détermination du sulfate de colistine
La concentration de sulfate de colistine a été déterminée par spectrométrie de masse HPLC-tandem [15]. Le sulfate de colistine a été pris comme étalon interne et la colonne chromatographique Dikma C18 (4,6 mm × 150 mm, 5 µm) a été adoptée, avec phase mobile A : eau (0,1 % d’acide méthanoïque) et phase mobile B : acétonitrile (0,1 % d’acide méthanoïque). acide). L’élution du gradient a été définie comme suit : 0 à 1 min, 95 % A, 5 % B ; 1 à 5 minutes : 25 % A, 75 % B ; 5 à 7 minutes : 5 % A, 95 % B ; 7 à 9 minutes : 95 % A, 5 % B. Le débit était de 0,8 mL·min−1 et la température de la colonne était de 40 °C. La spectrométrie de masse a été réalisée avec ionisation par pulvérisation d’électrons et mode ion positif de surveillance de réactions multiples. La paire d’ions quantitatifs constituée du sulfate de colistine E1, du sulfate de colistine E2 et du sulfate de colistine étalon interne a été m/z 585,7 → 101,2, m/z 578,8 → 101,2, et m/z 602,7 → 241,4, respectivement. Les potentiels de dégroupage étaient de 61 V, 59 V et 68 V, et les énergies de collision étaient respectivement de 47 V, 49 V et 33 V. Le volume d’injection de l’échantillon était de 20 µL et la durée de l’analyse était de 10 minutes. Le chromatogramme est présenté sur la figure 1, où les temps de rétention du sulfate de colistine E1 et du sulfate de colistine E2 sont respectivement de 5,68 et 5,58 minutes. La solution de référence, l’échantillon de plasma de contrôle qualité et l’échantillon clinique ont été quantifiés selon la courbe standard du jour du test.
Figure 1
Chromatogramme liquide haute performance du sulfate de colistine dans le plasma humain. UN Plasma vierge. B Contrôle à blanc de sulfate de colistine E1. C Contrôle à blanc de sulfate de colistine E2. D Contrôle à blanc standard interne. E Sulfate de colistine E1 dans des échantillons de plasma de patients après administration du médicament. F Sulfate de colistine E2 dans des échantillons de plasma de patients après administration du médicament. G Des échantillons de plasma enrichis en interne après l’administration du médicament
Inactivation du SRAS-CoV-2
Quinze aliquotes de solutions de référence de sulfate de colistine à des concentrations de 0,5 µg·mL⁻¹, 2 µg·mL⁻¹ et 5 µg·mL⁻¹ ont été prélevées à l’aide de tubes à centrifuger (matériau en polyéthylène), avec trois groupes (chacun contenant cinq aliquotes ) pour chaque concentration. Les opérations ultérieures ont toutes été réalisées dans le tube à centrifuger. Le premier groupe a été directement injecté sans traitement d’inactivation. Le deuxième groupe a été chauffé au bain-marie à 56 ± 5 °C pendant 30 min avant injection. Le troisième groupe a été exposé à la lumière ultraviolette (UV-C d’une longueur d’onde de 254 nm) pendant 60 minutes avant l’injection. Sur la base des résultats des tests visant à déterminer si les solutions de référence ont subi un traitement d’inactivation, cinq aliquotes d’échantillons de plasma de contrôle qualité à chaque concentration ont été traitées selon la procédure de « prétraitement des échantillons de plasma », puis soumises à une injection et à des tests.
Analyse de l’accord
L’analyse statistique du coefficient de corrélation intraclasse (ICC) des données a été réalisée avec le logiciel statistique SPSS 26.0. Lorsque ICC > 0,75, cela indique un niveau de confiance et une concordance élevés des données de test. La régression de Passing – Bablok et l’analyse statistique de Bland – Altman (B – A) ont été réalisées avec le logiciel MedCalc 20.0. Quand P.
Dans les « Lignes directrices pour les tests de stabilité des substances et préparations médicamenteuses » (9001) de la Pharmacopée chinoise 2020, le « changement significatif » dans la qualité de la préparation est défini comme une différence de 5 % entre le contenu et la valeur initiale. Par conséquent, la plage de précision de la substance de référence a été définie comme étant comprise entre 95 et 105 % de la valeur indiquée dans l’étude. Lorsque cette plage était dépassée, un tel composé aurait pu être considéré comme instable sous une telle inactivation du SRAS-CoV-2, et le test de stabilité ultérieur des échantillons biologiques ne serait pas pris en compte. De plus, les « Lignes directrices pour la validation des méthodes analytiques quantitatives des échantillons biologiques (9012) » indiquent que la précision moyenne des méthodes quantitatives pour les échantillons biologiques doit généralement se situer à ± 15 % de la valeur indiquée. Par conséquent, la plage de précision des échantillons biologiques de l’étude a été définie comme étant comprise entre 85 et 115 % de la valeur indiquée, et l’échantillon biologique serait considéré comme instable dans une telle opération s’il dépassait la plage. Enfin, la régression de Passing – Bablok et l’analyse B – A ont été réalisées pour évaluer la concordance entre les échantillons de sang pour la concentration plasmatique de sulfate de colistine mesurée cliniquement avant et après l’inactivation avec différentes méthodes d’inactivation.