Évaluation des performances d’Advantage Pf malaria Card® et Advantage malaria Pan + Pf Card®, deux tests de diagnostic rapide pour la confirmation parasitologique des cas de paludisme en situation de terrain au Togo | Parasites et vecteurs

Conception et sites de l’étude

Il s’agit d’une étude analytique transversale qui s’est déroulée de décembre 2019 à février 2020 au Togo. La transmission du paludisme est stable dans tout le pays, avec deux climats prédominants : le climat sub-équatorial avec deux saisons des pluies dans la partie sud du pays et le tropical avec une seule saison des pluies dans la partie nord. Ainsi, trois sites sentinelles de suivi de l’efficacité des ACT utilisés pour le traitement du paludisme simple ont été utilisés pour cette évaluation. Le Centre Médical Social (CSM) de Cacaveli, établissement public de santé de Lomé, capitale du Togo, a été le premier site auquel le CSM « UTB Circulaire » a été ajouté en raison de la fréquentation relativement faible des patients sur le site. Le SMC Ahépé, établissement public de santé de la région Maritime, a été le deuxième site, situé à 66 km de Lomé, auquel s’est également ajouté l’hôpital « la Providence de Kouvé ». Le dernier site était la polyclinique de Sokodé située dans la région Centre à environ 340 km au nord de Lomé. Les deux premiers sites étaient subéquatoriaux, situés respectivement en zone urbaine et rurale, et le troisième site était tropical, situé en zone semi-urbaine.

Population étudiée et échantillonnage

La population étudiée était constituée de patients symptomatiques suspectés de paludisme, vus en consultation dans les différents sites sentinelles et pour lesquels le TTBS a été prescrit. Puisque la sensibilité des TDR varie en fonction de la densité parasitaire [9, 10] et peut atteindre 100 parasites/μl, ce qui peut varier d’un produit à l’autre [11], les sujets à frottis sanguins positifs ont été divisés en deux groupes, un groupe à faible densité parasitaire (patients présentant une parasitémie asexuée par microlitre entre 50 et 1 000) et un groupe à forte densité parasitaire (ceux présentant une parasitémie asexuée par microlitre entre 2 000 et 10 000). Le groupe témoin comprenait des sujets négatifs pour toute espèce de Plasmodium.

Taille de l’échantillon

Les méthodes de calcul de la taille de l’échantillon de Buderer et al.. [12] ont été utilisées. Pour le calcul de la sensibilité et de la spécificité, nous avons utilisé la formule Np = (frac{{{Z}_{a/2}}^{2}mathrm{se}(1-se)}{{E}^{2}}) pour estimer le nombre de cas (positifs) à inclure et la formule Nn = (frac{{{Z}_{a/2}}^{2}mathrm{sp}*(1-sp)}{{E}^{2}}) pour estimer le nombre de contrôles (négatifs). Une sensibilité de 90 % a été estimée pour une parasitémie faible et de 95 % pour une parasitémie élevée avec une marge d’erreur tolérée (E) de 5 % et un risque d’erreur accepté (α) de 5 % (Zα/2 à 1,96) ; la taille des positifs à faible parasitémie à inclure était de 139 et le nombre de positifs à forte parasitémie à inclure était de 73. Pour une spécificité estimée à 90 %, le nombre de contrôles inclus était de 139. Par conséquent, cette étude doit inclure une taille totale d’échantillon. de 351 participants.

Critères d’inclusion et de non-inclusion

Les critères d’inclusion ont été examinés par groupe. Le groupe à faible parasitémie comprenait les patients présentant un nombre de parasitémie asexuée par microlitre compris entre 50 et 1 000 ; dans le groupe à forte parasitémie, ceux présentant une parasitémie asexuée par microlitre entre 2 000 et 10 000 ; et dans le groupe témoin, les individus présentant un frottis sanguin épais négatif [13,14,15]. Un consentement écrit signé a été obtenu de chaque patient adulte et du parent/tuteur légal des enfants avant leur inscription à l’étude. Toute personne ne répondant pas aux critères ci-dessus et ayant volontairement refusé de participer à l’étude n’a pas été incluse dans la population étudiée.

Collecte de données

Un questionnaire structuré a été utilisé pour recueillir des informations sur les caractéristiques sociodémographiques, les signes cliniques présentés, les antécédents de la maladie et l’existence d’autres maladies, le cas échéant.

Tests de laboratoire

Chaque patient a eu un prélèvement de sang capillaire pour un TTBS. Une fois les résultats de la microscopie connus (avoir une parasitémie dans une certaine plage ou être négatif pour le paludisme), un deuxième échantillon a été prélevé sur les sujets inclus pour tester les TDR évalués. Plasmodium spp. infection et des gouttes de sang séché (DBS) ont été réalisées sur du papier Wattman de type III.

Frottis de sang épais et fin

Les frottis épais et minces ont été réalisés sur la même lame. Deux diapositives ont été réalisées. Après avoir fixé la fine frottis sanguin avec du méthanol pendant quelques secondes, la première lame a été colorée au Giemsa 10%, 10 à 15 min, pour un premier dépistage (ayant une parasitémie dans une certaine fourchette ou étant négative pour le paludisme), et la seconde à 3% , 45 min pour un examen détaillé afin d’obtenir des résultats définitifs. [16]. Après séchage, les lames ont ensuite été lues au microscope à immersion avec un objectif 100× pour déterminer la positivité et identifier les espèces plasmodiales et estimer la parasitémie.

Tests de diagnostic rapides

Deux types de TDR de marque Advantage ont été évalués : Advantage Pf Malaria Card^® (IR016025), spécifique à Plasmodium falciparumet Advantage Malaria Pan + Carte Pf^® (IR231025), qui peut détecter P. falciparum, P. malariae, P. vivaxet P. ovale (J. Mitra & Co. Pvt. Ltd.). Les deux TDR sont basés sur la technique immunochromatographique : Advantage Pf Malaria Card®, utilisant un anticorps monoclonal anti-Pf HRP2, détecte l’antigène HRP2, spécifique de P. falciparumet Advantage Malaria Pan + Carte Pf^®en plus de P. falciparum-anticorps monoclonal anti-Pf HRP2 spécifique, détecte l’antigène pLDH (plasmodium lactate déshydrogénase), commun à toutes les espèces plasmodiales, à l’aide d’un Plasmodium-Anticorps monoclonal anti-Pan pLDH spécifique. Les deux TDR ont été réalisés simultanément en laboratoire par le personnel de l’étude pour chaque sujet inscrit conformément aux instructions du fabricant ainsi qu’à l’interprétation des résultats. Quatre microlitres de sang frais provenant d’une piqûre au doigt à l’aide de la coupe inversée (en touchant la base de la coupe inversée dans la goutte de sang) ont été immédiatement placés dans le puits d’échantillon, puis trois gouttes du tampon de test ont été ajoutées au puits tampon. Les résultats ont été lus après 20 min.

Test PCR en temps réel

Plasmodium L’ADN a été extrait par la méthode de chauffage décrite par Miura et al. [17]; le Qiagen^® Le kit a été utilisé conformément aux instructions du fabricant pour valider la méthode d’extraction par chauffage. La PCR en temps réel a été réalisée à l’aide d’amorces, de sondes et de conditions de réaction décrites par Shokoples et al. [18] et Divis et coll. [19] avec la modification suivante : les fluorophores pour le P. falciparum les sondes ont été remplacées par Cy5-BHQ-1 [20]. Deux réactions distinctes ont été réalisées : (i) une réaction de dépistage de la présence de Plasmodium espèce avec Plasmodium paire d’amorces conservées par genre (Plasmo1 et Plasmo2) et Plasprobe pour détecter une région conservée du Plasmodium Gène de l’ARNr 18S ssu des cinq parasites humains du paludisme [21]; (ii) une PCR monoplexe pour la détection de P. falciparum en utilisant une amorce directe spécifique à l’espèce associée à Plasmo2 et à des sondes spécifiques à l’espèce [18]. En bref, les tests de criblage et monoplexes ont été réalisés avec un volume final de 25 μl contenant 5 μl d’ADN matrice, 12,5 μl de mélange maître PCR QuantiFast Multiplex (Qiagen, Allemagne) et 7,5 μl de mélange d’amorces et de sondes regroupées. Tous les tests ont été réalisés dans des conditions standard (1 cycle à 95 °C pendant 5 min ; 45 cycles répétés à 95 °C pendant 30 s et 60 °C pendant 30 s) avec l’appareil PCR en temps réel CFX96 (Bio-Rad, USA ).

Contrôle de qualité

Une lecture en double a été effectuée par deux microscopistes expérimentés pour chaque TTBS [22]. Si le coefficient de variation de l’estimation de la densité parasitaire était > 5 %, une troisième lecture était réalisée par un autre microscopiste indépendant. [16]. S’il y avait une différence entre la parasitémie des sites d’étude et les résultats trouvés par le contrôle qualité, la parasitémie du contrôle qualité était prise en compte. La parasitémie estimée a été utilisée pour constituer les trois groupes.

Les résultats du RDT sont considérés comme valides et interprétés uniquement en présence de la ligne de contrôle à la fin du test, selon les instructions du fabricant.

Un seuil de 40 cycles a été utilisé pour définir les échantillons positifs à la PCR. Le panel de test comprenait plusieurs contrôles : (i) une extraction d’échantillon négatif comme contrôle négatif, (ii) une amplification cible de la β2-macroglobuline (β2M) (seuil de cycle < 40) comme contrôle d'extraction positif pour l'échantillon, et (iii) un test positif. contrôle de référence pour détecter toute variation entre les exécutions et contrôle sans modèle pour chacun des master mix [20, 21].

Une formation des membres de l’équipe du site et des superviseurs a été réalisée pour standardiser les méthodes de travail et assurer le bon déroulement de l’activité, notamment pour le remplissage des questionnaires et la réalisation des TDR, TTBS et échantillonnages sur papier filtre.

Points de terminaison

Le frottis sanguin épais/mince et la PCR ont été considérées comme les méthodes de référence dans cette évaluation à laquelle les deux TDR ont été comparés. La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) sont les indicateurs de performance estimés de ces deux TDR. La sensibilité et la VPP ont été calculées pour les parasitémies faibles et élevées.

Gestion et analyse des données

Les données ont été enregistrées sur des formulaires de registre, saisies dans une base de données Microsoft Excel (Microsoft Corp, Redmond, Washington, USA) et analysées à l’aide du logiciel EpiInfoTM version 3.5.1. La sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives des TDR ont été déterminées par microscopie (ou PCR), à l’aide de tableaux de contingence 2 × 2. Des intervalles de confiance exacts à 95 % (IC à 95 %) ont été calculés pour chaque mesure répertoriée ci-dessus.

Considérations éthiques

Le protocole d’étude a obtenu l’autorisation éthique du Comité de Bioéthique pour la Recherche en Santé (CBRS) du Togo (n°046/2019/CBRS du 21 novembre 2019) avant sa mise en œuvre. De plus, le consentement signé a été obtenu des adultes et des parents/tuteurs des enfants. Tout patient détecté positif par au moins une des méthodes était référé aux cliniciens des sites pour une prise en charge gratuite avec un médicament antipaludique disponible via le Programme national de lutte contre le paludisme.