Expansion des lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains et leurs réponses cytotoxiques contre le cholangiocarcinome

Immunophénotypage de cultures de cellules T Vγ9Vδ2

Les PBMC provenant de donneurs sains ont été cultivées simultanément dans l’une des trois conditions suivantes : milieu complet contenant 5 µM de zolédronate et 200 UI d’IL-2/ml seul, ou avec 30 ng d’IL-15/ml, ou avec 30 ng d’IL-18/ml ou avec ni l’un ni l’autre. Toutes les mesures ultérieures de cytométrie en flux ont été effectuées après déclenchement sur des cellules T γδ. Les évaluations par cytométrie en flux à la fin de la culture du phénotype et de la viabilité ont indiqué que les trois protocoles aboutissaient à un nombre élevé de Vδ2 viables.⁺ Cellules T (IL-2 = 96,53 % ± 0,55, IL-15 = 91,68 % ± 1,56, IL-18 = 93,00 % ± 1,61). Le nombre de cellules dans ces trois groupes qui a augmenté avec le temps de culture peut refléter l’efficacité des protocoles dans la prolifération des cellules. Après la méthode de purification, les cellules isolées étaient constituées de > 98 % de lymphocytes T Vγ9Vδ2, comme déterminé par analyse FACS (résultat représentatif sur 6 expériences différentes dans chacun des trois protocoles). Il est intéressant de noter que le zolédronate et l’IL-2, sans IL-15 ni IL-18, ont fourni les meilleurs résultats en ce qui concerne un pourcentage élevé de Vδ2.⁺ Cellules T avec un pourcentage significativement élevé de CD158, également appelés KIR (récepteurs de type immunoglobuline de cellules tueuses) (IL-2 = 12,07 % ± 0,78/IL-2,Zol,IL-15 = 10,34 % ± 0,38/IL-2, Zol, IL-18 = 7,93 ± 0,69) [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-18 = 4.14, 2.22–6.06, p = 0.001, and between IL-2,Zol,IL15 and IL-2,Zol,IL-18 = 2.41%, 0.48–4.33, p = 0.02] (Fig.1A). De plus, aucune différence significative n’a été observée dans l’expression du CTLA4 sur les lymphocytes T γδ stimulés avec les différents protocoles.

Analyse de l’expression des gènes des cytokines

Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 ont ensuite été analysés pour déterminer leur expression des gènes de cytokines IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12β, IL-15 et IL-17 en utilisant la PCR en temps réel. L’expression de tous les gènes de cytokines a pu être observée avec les trois protocoles de culture. La détermination du modèle d’expression génique des cellules T Vγ9Vδ2 cultivées à partir du sang périphérique de tous les donneurs sains a indiqué qu’il n’y avait que l’expression du gène IL-8 avec une augmentation significative de l’état avec l’IL-2 seule par rapport à l’IL-2, Zol, IL-15. (IL-2 = 0,0007 ± 0,0005/IL-2,Zol,IL-15 = 0,00025 ± 0,0001) [MD, 95%CI = 0.0005, 0.00004 ± 0.0009, p = 0.048] ainsi que l’expression du gène IL15 avec une augmentation significative de l’état avec l’IL-2 seule par rapport à l’IL-2, Zol, IL-15 et à l’IL-2, Zol, IL-18 (IL-2 = 0,00004 ± 0,0003/IL-2 ,Zol,IL-15 = 0,00001 ± 0,00001/IL-2,Zol,IL-18 = 0,00001 ± 0,00001) [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-15 = 0.00003, 0.0001–0.00005, p = 0.047] [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-18 = 0.00003, 0.0001–0.00006, p = 0.012]. Cependant, il n’y avait pas de différences significatives entre nos trois protocoles en ce qui concerne l’IL-1b, l’IL-2, l’IL-6, l’IL-7, l’IL-12b et l’IL-17. Cela pourrait laisser entendre que la culture de cellules T Vγ9Vδ2 complétée par ces cytokines de soutien conduit à la même qualité de cellules T Vγ9Vδ2 (Fig. 2).

Analyse PCR en temps réel de l’expression des gènes des cytokines dans les cellules T Vγ9Vδ2 expansées. Des lymphocytes T Vγ9Vδ2 provenant de 6 donneurs sains ont été propagés comme décrit et analysés pour les niveaux d’expression d’ARNm codant pour IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12β, IL-15 et IL-17. . Les données affichées sont les résultats de tous les cas testés. Les lignes représentent les valeurs moyennes.

Analyse du profil apoptotique des cultures de cellules T Vγ9Vδ2

Pour déterminer si différents protocoles de génération de lymphocytes T Vγ9Vδ2 entraînent une signalisation différentielle pro- et anti-apoptotique, les niveaux d’ARNm de diverses molécules de signalisation ont été analysés. D’après les résultats de la PCR en temps réel, l’expression des signaux pro-apoptotiques, en particulier la caspase 3, était significativement diminuée dans le protocole de stimulation par l’IL-15 et l’IL-18 par rapport au protocole par l’IL-2 (moyenne ± écart-type de l’IL-2 = 4,16). ± 1,45/IL-2,Zol,IL-15 = 1,44 ± 0,11/IL-2,Zol,IL-18 = 2,78 ± 0,46) [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-15 = 2.72, 2.32–3.12, p < 0.01, and between IL-2 and IL-2,Zol,IL-18 = 1.38%, 0.89–1.79, p < 0.01]. La caspase 8 était significativement diminuée dans l'IL-15 et l'IL-18 (Moyenne ± ET de l'IL-2 = 1,87 ± 0,17 / IL-2,Zol,IL-15 = 1,43 ± 0,10 /IL-2,Zol,IL-18 = 1,38 ± 0,33) [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-15 = 0.44, 0.11–0.87, p = 0.02, and between IL-2 and IL-2,Zol,IL-18 = 0.49%, 0.41–1.84, p < 0.01]. La caspase 9 était significativement diminuée dans l'IL-15 et l'IL-18 (Moyenne ± ET de l'IL-2 = 0,18 ± 0,01/IL-2,Zol,IL-15 = 0,13 ± 0,01/IL-2,Zol,IL-18 = 0,15 ± 0,01) [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-15 = 0.06, 0.41–0.74, p < 0.01, and between IL-2 and IL-2,Zol,IL-18 = 0.36%, 0.19–0.52, p < 0.01]. BCL-2 était significativement augmenté dans l'IL-15 mais pas de différence significative dans l'IL-18 (Moyenne ± ET de l'IL-2 = 0,07 ± 0,01/IL-2,Zol,IL-15 = 0,14 ± 0,01/IL-2, Zol, IL-18 = 0,09 ± 0,01) [MD, 95%CI between IL-2 and IL-2,Zol,IL-15 = 0.07, 0.04–0.98, p < 0.01] (Fig. 3).

Analyse PCR en temps réel de l’expression des gènes pro- et anti-apoptotiques dans les cellules T Vγ9Vδ2 expansées. Des lymphocytes T Vγ9Vδ2 provenant de 6 donneurs sains ont été propagés comme décrit et analysés pour déterminer les niveaux d’expression d’ARNm codant pour la caspase 3, la caspase 8, la caspase 9 et bcl-2. Les données affichées sont les résultats de tous les cas testés. Les lignes représentent les valeurs moyennes.

Les cellules de cholangiocarcinome traitées au zolédronate ont augmenté la cytotoxicité des cellules T Vγ9Vδ2

L’activité cytotoxique des cellules T Vγ9Vδ2 expansées provenant de donneurs sains contre des lignées cellulaires de cholangiocarcinome a été testée. Les deux lignées cellulaires, HuCCT1 et TFK-1, ont été efficacement tuées par les lymphocytes T Vγ9Vδ2. Les cellules HuCCT1 étaient plus susceptibles d’être tuées par les cellules T Vγ9Vδ2 que par les cellules TFK-1. Le traitement au zolédronate pendant 24 h était suffisant pour rendre les lignées cellulaires HuCCT1 et TFK-1 très sensibles à la destruction des lymphocytes T Vγ9Vδ2 (rapport E:T de 10:1). Les données ont montré des niveaux croissants de cytotoxicité dans HuCCT1 traité par le zolédronate par rapport aux cellules non traitées dans trois protocoles (moyenne ± écart-type de l’IL-2 = 74,02 ± 12,80, p = 0.04/ IL-2,Zol,IL-15 = 78.36 ± 11.20, p = 0.02 /IL-2,Zol,IL-18 = 67.35 ± 4.47, p= 0,04) (Fig. 4A). De plus, l’activité cytotoxique envers les cellules cibles HuCCT1 et TFK-1 des cellules T Vγ9Vδ2 traitées au zolédronate a été comparée. Les cellules T Vγ9Vδ2 du protocole de stimulation par l’IL-15 tuent apparemment les cellules cibles TFK-1 de manière significativement moins importante que les autres groupes (Moyenne ± ET de l’IL-2 = 44,14 ± 3,99/IL-2,Zol,IL-15 = 34,59 ± 2,50/ IL-2,Zol,IL-18 = 43,15 ± 2,25) [P-value between IL-2 and IL-2,Zol,IL-15 = 0.01, and between IL-2,Zol,IL-15 and IL-2,Zol,IL-18 = 0.001]. Dans les mêmes expériences, les rapports E: T ont varié à 1: 1, 5: 1, 10: 1, 20: 1 pour démontrer l’activité cytotoxique envers les cellules de cholangiocarcinome des cellules T Vγ9Vδ2. Aux rapports E:T de 1:1 et 5:1, l’activité cytotoxique des cellules T Vγ9Vδ2 n’a pas changé de manière significative, alors qu’aux rapports E:T de 20:1, des résultats similaires à ceux de 10:1 ont été obtenus avec des cellules T Vγ9Vδ2 expansées dérivées provenant de donneurs sains.

Cytotoxicité des cellules T Vγ9Vδ2 contre les cellules de cholangiocarcinome. Les propriétés cytotoxiques des cellules T Vγ9Vδ2 cultivées contre les lignées cellulaires de cholangiocarcinome HuCCT1 et TFK-1 sont présentées. (UN) Les pourcentages de cellules apoptotiques à un rapport E:T de 10:1 sont indiqués, comparant l’ajout ou la non-ajout de zolédronate pendant 24 h. Les données présentées sont les valeurs moyennes de cytotoxicité ± SD issues des 3 expériences indépendantes réalisées avec différentes lignées de cellules T Vγ9Vδ2. (B) Panneaux représentatifs de cytométrie en flux avec déclenchement pour les cellules tumorales marquées par des traces de cellules et tracés d’histogramme de l’annexine V⁺ cellules fermées provenant d’un contrôle (lignées cellulaires de cholangiocarcinome sans cellules T Vγ9Vδ2) et co-cultures de lignées cellulaires de cholangiocarcinome et de cellules T Vγ9Vδ2.

Tuerie des cellules de cholangiocarcinome médiée par la voie CD107

Pour déterminer les mécanismes possibles impliqués dans la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T Vγ9Vδ2, nous avons examiné l’expression à la surface cellulaire d’une protéine membranaire associée au lysosomal (LAMP-1). Également connue sous le nom de CD107a, il s’agit d’une protéine membranaire intégrale localisée dans des granules cytolytiques mobilisées de manière transitoire à la surface de la cellule lors de la dégranulation. Comme le montre la figure 5A, l’expression moyenne de CD107a à la surface des cellules T Vγ9Vδ2 exposées aux lignées cellulaires HuCCT1 et TFK-1 était supérieure à celle du contrôle, en particulier dans HuCCT1 dans nos trois protocoles (moyenne ± écart-type d’IL-2, Zol = 29,29 ± 2,96, p = 0.04/IL-2,Zol,IL-15 = 30.20 ± 10.05, p< 0,001/IL-2,Zol,IL-18 = 29,40 ± 5,60, p< 0,001). Sur la base de ces premiers résultats, les deux lignées cellulaires de cholangiocarcinome peuvent activer le processus de dégranulation des cellules T Vγ9Vδ2.

Pourcentage de lymphocytes T Vγ9Vδ2 exprimant le CD107a de surface. (UN) Pourcentage de CD107⁺ Vγ9Vδ2⁺ Les lymphocytes T à un rapport E:T donné sont présentés par rapport au contrôle. Les données présentées sont les valeurs moyennes ± SD de 3 expériences indépendantes réalisées avec différentes lignées de cellules T Vγ9Vδ2. (B) Panneaux représentatifs de cytométrie en flux avec déclenchement pour CD107⁺ Vγ9Vδ2⁺ Cellules T, entre inclusion et non-inclusion d’une lignée cellulaire de cholangiocarcinome après 4 h.