Les moustiques
Les moustiques destinés aux expériences ont été élevés à l’unité de recherche sur les insecticides du département d’entomologie médicale de la faculté de médecine tropicale de l’université Mahidol de Bangkok, en Thaïlande. Des moustiques Anopheles dirus (souche Kaw Mai Khaw) ont été élevés comme décrit précédemment. [16], avec des modifications mineures d’un environnement d’élevage de 28 ± 2 °C, 80 ± 10 % d’humidité relative et une photopériode lumière/obscurité de 12/12 h. Les larves d’Anopheles dirus ont été élevées à une densité de 200 par plateau (28 × 35 × 5 cm), avec de la poudre de nourriture pour poisson (Optimum ; Perfect Companion Group Co., Ltd., Bangkok, Thaïlande) fournie quotidiennement en quantités de 0,01 à 0,04 g. par plateau pendant les premier et deuxième stades et 0,05 à 0,06 g par plateau pour les troisième et quatrième stades. Les moustiques Anopheles minimus (souche Saraburi) ont été élevés de la même manière, avec une modification mineure au cours de l’élevage des larves, la quantité quotidienne de poudre de nourriture pour poissons fournie à 200 larves par plateau était de 0,01 à 0,02 g pendant les premier et deuxième stades, et de 0,03 à 0,03 g. 0,04 g par plateau pour les troisième et quatrième stades. Les pupes ont été transférées dans des gobelets en plastique et placées dans une cage (30 × 30 × 30 cm). Les moustiques adultes ont reçu du coton imbibé d’une solution de sucre à 5 % (Lin, Thai Roong Ruang Sugar Group Co., Ltd., Phetchabun, Thaïlande) mélangée à une solution de sirop multivitaminé à 5 % (Seven Seas, PT ; Merck Tbk., Jakarta, Indonésie); le coton était changé une fois par semaine.
Les larves de moustiques utilisées pour les expériences ont été élevées de la manière décrite ci-dessus. Les pupes utilisées pour les expériences ont été transférées dans des cylindres en plastique (16 diamètre × 16,5 cm, diamètre × hauteur) remplis de 60 ml d’eau et scellés avec un tamis. Les moustiques adultes ont reçu une solution de sucre à 5% mélangée à une solution de sirop multivitaminé à 5% pendant les 48 heures suivant l’émergence, puis avec une solution de saccharose à 10% ad libitum jusqu’aux expériences. Les moustiques destinés aux expériences étaient âgés de 5 à 7 jours après leur émergence au moment de l’alimentation en sang. Les moustiques ont été transférés doucement par aspiration dans des récipients cylindriques en carton de 0,5 litre scellés avec un grillage au sommet, chaque récipient contenant 40 moustiques. Les moustiques ont été maintenus dans un incubateur vertical maintenu à 25 ± 1 °C et à 80 ± 10 % d’humidité relative sous une photopériode lumière/obscurité de 12/12 h. Les moustiques étaient affamés de sucre mais avaient accès à l’eau 16 à 20 heures avant leur repas de sang.
Composés
L’ivermectine racémique a été obtenue auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L’ivermectine B1a en poudre (pureté à 95,0%) a été obtenue auprès de Toronto Research Chemicals (Toronto, ON, Canada). L’ivermectine B1b en poudre (pureté à 99, 27%) a été obtenue auprès de ClearSynth Labs (Mumbai, Inde). Les comprimés d’ivermectine à 6 mg (Vermectin®) ont été obtenus auprès d’Atlantic Laboratories Corp., LTD (Bangkok, Thaïlande).
Préparation du repas de sang de moustique
Tous les composés ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 2 mg / ml et les solutions ont été congelées à – 20 ° C jusqu’aux expériences d’alimentation des moustiques. Du sang total a été collecté auprès de volontaires sains dans des tubes d’héparine de sodium le jour de chaque alimentation par membrane de moustique. Les solutions mères congelées des composés ont été décongelées et des dilutions en série ont été réalisées dans du plasma AB + humain à l’aide de flacons en verre ambré. La solution mère de plasma finale (10 µl) a été mélangée à du sang total vierge (990 µl) pour atteindre la concentration finale souhaitée pour les tests d’alimentation sur membrane de moustique. Pour les expériences avec An. dirus, des composés d’ivermectine à des concentrations allant de 2 à 30 nM ont été donnés aux moustiques ; pour un. minimus, les concentrations variaient de 0,25 à 4 nM. Tous les échantillons de sang préparés pour l’alimentation des moustiques contenaient < 1 % de solvant organique. Des repas de sang témoin ont été préparés ; il s'agissait de DMSO congelé sans composés d'ivermectine dilués dans le plasma pour correspondre au rapport DMSO: sang le plus élevé dans les repas de sang contenant le composé.
Tests d’alimentation et de mortalité sur membrane de moustique
À chaque alimentation de membrane de moustique, du sang total mélangé aux différents composés dans une plage de concentrations a été fourni à des groupes de 40 An. dirus et 40 An. minimus via des mangeoires à membrane réchauffées à 37 °C. Les moustiques ont pu se nourrir pendant 30 minutes maximum. Après alimentation par membrane, jusqu’à 30 moustiques nourris avec du sang par récipient ont été transférés doucement par aspiration dans des récipients en carton propres (0,5 l) et les récipients ont été maintenus dans un incubateur à 25 ± 1 °C et 80 ± 10 % d’humidité avec une humidité de 12/12. -h photopériode claire/sombre. Les moustiques ont reçu 10% de saccharose ad libitum. La survie des moustiques a été surveillée quotidiennement pendant 10 jours après la prise de sang, et tous les moustiques morts ont été éliminés par aspiration et enregistrés. Dix jours après le repas de sang, tous les moustiques restants ont été enregistrés comme vivants puis congelés.
Mesures par chromatographie liquide et spectrométrie de masse de l’ivermectine B1a et B1b
L’ivermectine racémique a été dissoute dans un rapport méthanol:eau 50:50 jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml, puis diluée 10 000 fois dans un rapport acétonitrile/eau 40:60. Un échantillon de 5 µl de la solution diluée d’ivermectine (100 ng/ml) a été injecté dans le système de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC – MS). Un comprimé d’ivermectine a été écrasé dans un mortier et 1 mg de poudre a été dissous dans un rapport méthanol:eau 50:50 jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml. Le mélange de comprimés broyés a été dilué 10 000 fois dans un rapport acétonitrile: eau 40:60 et soniqué pendant 30 minutes. Un échantillon de 5 µl d’ivermectine diluée (100 ng/ml) a été injecté dans le système LC-MS. L’ivermectine B1a et B1b du comprimé et de la poudre d’ivermectine racémique ont été mesurées pour dériver les rapports B1a à B1b.
Le système LC-MS utilisé était un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC) (pompe quaternaire Agilent 1260, échantillonneur automatique haute performance Agilent 1260 et compartiment à colonne thermostatique Agilent 1290 SL ; Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis) couplé à un quadripôle. spectromètre de masse à temps de vol (Q-TOF-MS) (TripleTOF 5600+ ; Sciex, Framingham, MA, USA), avec ionisation par électrospray (ESI) utilisant une source d’ions DuoSpray. La phase mobile HPLC était de l’eau contenant 10 mM d’acétate d’ammonium et 0,1 % d’acide formique (phase mobile A) et de l’acétonitrile : eau dans un rapport 95:5 (v/v) contenant 10 mM d’acétate d’ammonium et 0,1 % d’acide formique (phase mobile B). ). Les flacons LC ont été conservés dans l’échantillonneur automatique à 6 ° C pendant l’analyse. Les mélanges d’échantillons ont été injectés sur une colonne C18 en phase inversée (Acquity UPLC HSS T3, 2,1 × 100 mm, 1,8 µm; Waters Corp., Milford, MA, USA) protégée par une précolonne (Acquity UPLC HSS T3, 2,1 × 5 mm, 1,8 μm ; Waters Corp.) pour une séparation à un débit de 0,3 ml/min à 40 °C. Le gradient d’élution HPLC a commencé à 40 % de phase mobile B pendant 2,0 min (0 à 2,0 min), suivi de 40 à 80 % de B pendant 2,0 min (2,0 à 4,0 min), 80 à 100 % de B pendant 5,0 min (4,0 à 9,0 min). min), 100 % B pendant 5,0 min (9,0 à 14,0 min), 100 à 40 % B pendant 0,1 min (14,0 à 14,1) et 40 % B pendant 3,9 min (14,1 à 18,0 min). Le système HPLC-Q-TOF-MS, le chromatogramme d’ions de masse et les spectres de masse ont été acquis par le logiciel Analyst™ version 1.7 (Sciex). Le Q-TOF-MS a fonctionné en mode ESI-positif, les gaz sources d’ions 1 et 2 à 40 psi chacun, le gaz rideau à 30 psi, la tension de pulvérisation d’ions à 4 500 V, la température de la source à 350 °C et le potentiel de dégroupage à 120 V. Les données ont été acquises en mode d’acquisition dépendant de l’information, composé d’un balayage TOF-MS et de 10 balayages d’ions produits dépendants en mode haute sensibilité avec soustraction de fond dynamique. La plage de masse du balayage TOF-MS était de m/z 100 à 1 000 et celle des ions produits était de m/z 50 à 1 000. La quantification du niveau d’ivermectine B1a et B1b a été réalisée par le logiciel MultiQuant™ (Sciex) avec un mode de numérisation TOF-MS haute résolution.
analyses statistiques
Les concentrations mortelles qui tuent 50 % et 90 % des moustiques (CL50 et CL90, respectivement) ont été estimées à l’aide d’une analyse concentration-réponse normalisée à quatre variables (IC50 [half-maximal inhibitory concentration]Colline [Hill-Slope]ÉMIN [point of minimum mortality]et EMAX [point of maximum mortality]). Tous les paramètres ont été estimés à partir des données observées, à l’exception d’EMAX, qui a été supposé atteindre 100 % à des concentrations infinies. Les intervalles de confiance à 95 % (IC à 95 %) autour des estimations ponctuelles ont été calculés à l’aide d’une approximation symétrique (asymptotique). Toutes les analyses de survie des moustiques ont été réalisées avec GraphPad Prism v.10.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, Californie, États-Unis).
2024-05-15 22:54:42
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