Ingénierie et caractérisation de mutants de coronavirus aviaire exprimant des protéines rapporteurs fluorescentes à partir du gène de réplicase

Le virus de la bronchite infectieuse (IBV) est un coronavirus aviaire qui provoque la bronchite infectieuse, une maladie respiratoire aiguë et très contagieuse des poulets. L’évolution de l’IBV sous la pression d’une vaccination complète et généralisée nécessite une surveillance de la résistance aux vaccins, ainsi que des mises à jour périodiques des vaccins. Les systèmes de génétique inverse sont des outils très précieux en virologie, car ils facilitent la manipulation génétique rapide des génomes viraux, faisant ainsi progresser la recherche fondamentale et appliquée. Nous rapportons ici la construction d’un clone infectieux de la souche Beaudette d’IBV en tant que chromosome artificiel bactérien (BAC). Le clone IBV de pleine longueur modifié a permis le sauvetage d’un virus infectieux qui était phénotypiquement impossible à distinguer du virus parental. Nous avons utilisé le clone IBV infectieux et examiné si une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) peut être produite par le gène de la réplicase ORF1 et libérée de manière autocatalytique à partir de la polyprotéine de la réplicase par clivage par la principale protéase du coronavirus. Nous montrons que l’IBV tolère l’insertion de l’ORF EGFP à l’extrémité 3′ du gène de la réplicase, entre les séquences codant pour nsp13 et nsp16 (hélicase, ARN exonucléase, ARN endonucléase et ARN méthyltransférase). Nous montrons en outre que l’EGFP est efficacement clivée de la polyprotéine réplicase et peut être localisée dans des vésicules à double membrane avec l’ARN polymérase virale et l’ARN double brin, un intermédiaire de la réplication du génome de l’IBV. L’un des virus rapporteurs EGFP modifiés était génétiquement stable lors du passage dans des cellules en culture. Nous démontrons que les virus rapporteurs EGFP peuvent être utilisés pour étudier la réplication du virus dans les cellules hôtes et pour la découverte de médicaments antiviraux et le développement de tests de diagnostic. IMPORTANCE Les systèmes de génétique inverse basés sur des chromosomes artificiels bactériens (BAC) sont les systèmes les plus précieux dans la recherche sur les coronavirus. Nous décrivons ici la mise en place d’un système de génétique inverse pour la souche de coronavirus aviaire Beaudette, la souche la plus étudiée. Nous avons cloné une copie du génome du coronavirus aviaire dans un vecteur BAC et récupéré le virus infectieux dans des cellules permissives. Nous avons utilisé le nouveau système pour construire des virus rapporteurs qui produisent une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP). La séquence codante de l’EGFP a été insérée dans 11 sites de clivage connus de la principale protéase du coronavirus dans le gène de la réplicase ORF1. Le coronavirus aviaire a toléré l’insertion de la séquence codante EGFP sur trois sites. Les virus rapporteurs modifiés se sont répliqués avec une efficacité parentale dans des cellules cultivées et étaient suffisamment stables génétiquement. Le nouveau système facilite la génomique fonctionnelle du génome du coronavirus aviaire, mais peut également être utilisé pour le développement de nouveaux vaccins et médicaments anticoronaviraux.