Souris
Des souris BALB/c adultes (âgées de 6 à 8 semaines) ou néonatales (âgées de 7 jours) ont été obtenues auprès de Charles River Ltd. (St Mary’s, Royaume-Uni) et entretenues conformément aux directives de l’établissement et du ministère de l’Intérieur. Toutes les expériences ont été réalisées dans la salle SPF de l’animalerie selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures à 20-24 °C avec 55 % ± 10 % d’humidité à l’Imperial College de Londres, campus de l’hôpital St Mary. Tous les travaux ont été approuvés par le Comité d’examen du bien-être animal et de l’éthique de l’Imperial College de Londres, et les études étaient conformes aux directives Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE).
Pour l’infection grippale, les souris ont été infectées sous anesthésie avec 5 × 104 PFU dans 100 μl (adultes) ou 400 PFU dans 20 μl (nouveau-nés) H1N1/Eng/195.
Isolement des cellules des poumons et des voies respiratoires
Cytométrie en flux
Les cellules pulmonaires vivantes et les cellules de BAL ont été étalées sur une plaque à 96 puits en forme de U, puis centrifugées à 2 000 tr/min pendant 2 min à 4 °C. Au total, 100 µl de colorant violet Live/Dead (ArCTM, catalogue : A10346) ont été ajoutés pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité, la plaque a ensuite été centrifugée à 2 000 tr/min pendant 2 min et le surnageant a été retiré. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans un bloc Fc (Clone : 2.4G2) dans du PBS-1 % BSA et coloré avec les anticorps de surface suivants : FITC anti-CD3 de souris (Clone : 12A2, Cat : 100204, BioLegend), APC-H7 anti- CD8 (Clone : 53-6.7, Cat : 560247 BD Biosciences), BV605 anti-CD103 (Clone : 2E7, Cat : 121433 BioLegend), APC anti-souris CD69 (Clone : H1.2F3, Cat : 104513 BioLegend), PerCP-Cy5.5 anti-souris CD4 (Clone : RM4-5, Cat : 100540 BioLegend), BV711 anti-souris CD44 (Clone : IM7, Cat : 103057 BioLegend), PE-Cy7 anti-souris CD62L (Clone : MEL-14, Cat : 104418 BioLegend) pendant une heure dans l’obscurité. Les anticorps en excès ont été lavés trois fois avec 1% de BSA dans du PBS avant d’être filtrés à travers les tubes FAC sur un cytomètre LSR Fortessa Flow (BD) et FlowJo. Des contrôles fluorescents moins un (FMO) ont été utilisés pour les taches de surface. L’analyse a été réalisée à l’aide de FlowJo et fermée, comme le montre la figure S1.
Transfert de cellules des voies respiratoires
Les cellules ont été collectées dans BAL, lavées et remises en suspension dans du PBS stérile. Les souris ont été anesthésiées et 106 cellules dans 100 µl ont été administrées par voie intranasale avec une pipette Gilson.
qPCR
L’ARN a été extrait du lobe du poumon gauche en homogénéisant d’abord le tissu à l’aide d’un TissueLyzer (Qiagen, Manchester, Royaume-Uni) à 50 oscillations pendant 4 min, suivi d’un TRIzol (QIAzol, 79306; Qiagen) et d’une extraction au chloroforme. Les concentrations d’ARN ont été déterminées à l’aide d’un Nanodrop avant d’être converties en ADNc à l’aide d’un système de transcription inverse GoScript (code produit A5001 ; Promega, Royaume-Uni) et 2 µg pour tous les échantillons. La qPCR pour le gène RSV L a été réalisée sur un Stratagene Mx 3005p (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) en utilisant les amorces 5′-GAACTCAGTGTAGGTAGAATGTTTGCA-3 ‘et 5′-TTCAGCTATCATTTTCTCTGCCAA-3’ et la sonde 5′-6-carboxyfluorescéine. (FAM) -TTTGAACCTGTCTGAACAT-6-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) -3 ‘. Le nombre de copies d’ARN par mg d’ARN pulmonaire a été déterminé à l’aide d’un standard du gène RSV L. Les niveaux d’expression génique du gène RSV L ont été normalisés par rapport au nombre de copies GAPDH.
Extraction, traitement et normalisation de l’ARN
L’ARN pulmonaire a été extrait par extraction au QIAzol (Qiagen) et au chloroforme. Le contrôle qualité de l’ARN et la préparation de la bibliothèque ont été réalisés par Novogene à l’aide d’Illumina HiSeq à une profondeur cible de 50 millions de lectures d’extrémité de paire de 100 à 150 pb par échantillon. La qualité des lectures Raw RNAseq générées a été évaluée à l’aide de FastQC (v0.11.9) pour garantir des scores de bonne qualité, un contenu GC et l’absence de lecture d’adaptateur, puis un ajustement approprié a été effectué à l’aide du programme Trimmomatic (v1.0.40). Les lectures brutes ont ensuite été cartographiées sur le génome de référence de la souris (Gmc38) à l’aide de STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference, v6.2.0) et les données de comptage pour chaque gène ont été effectuées à l’aide de Salmon (v1.2.0). L’analyse en composantes principales (ACP) et la visualisation de cartes thermiques sur des données de séquence normalisées ont été analysées par la méthode de transformation stabilisatrice de variance. La fonction R prcomp() a été utilisée pour PCA dans le package devtools (v2.4.2) et la visualisation de la carte thermique a été réalisée avec la fonction heatmap.2 dans le package gplot (v3.1.1).
Analyse d’expression différentielle
L’analyse différentielle de l’expression génique a été réalisée à l’aide de l’analyse différentielle DeSeq242 pour obtenir une liste de gènes, P. valeurs, ajustées P. les valeurs et les changements de pli log2 avec des valeurs de changement de pli log positif indiquant une augmentation de l’expression des gènes et des valeurs négatives diminuant l’expression des gènes. Le taux de fausses découvertes (FDR) a été calculé en appliquant la méthode pondérée de Benjamin – Hochberg pour tester plusieurs hypothèses. Un gène était considéré comme exprimé différentiellement si le changement absolu était supérieur à 0,5 avec une valeur ajustée. P.-valeur
Ontologie des gènes et analyse du réseau KEGG
ClusterProfiler43 a été utilisé pour évaluer l’enrichissement des voies d’ontologie génique (GO) dans chaque liste de gènes. L’analyse du réseau des termes GO a été analysée à l’aide de la fonction emapplot du package clusterProfiler. La voie KEGG a été analysée à l’aide de la fonction gseKEGG. Les listes de gènes analysées incluent les gènes identifiés comme étant significativement différentiellement variables et les gènes appartenant à un terme GO spécifique. Une analyse d’enrichissement de l’ensemble de gènes (GSEA) a été réalisée où le score d’enrichissement a été calculé comme -log10 (P.-valeur)44. L’analyse du réseau des voies KEGG (visualisation du réseau et clustering) a été réalisée avec NetworkAnalyst45. Le code R est disponible sur demande.
Dosage multiplex des cytokines (souris)
Les niveaux de cytokines pulmonaires ont été mesurés à l’aide de kits commerciaux U PLEX multi-spots de Meso Scale Discovery (MSD) et effectués conformément aux instructions du fabricant. Les données ont été analysées et les limites inférieures de quantification (LLOQ) ont été déterminées à l’aide du logiciel MSD DISCOVERY WORKBENCH.
Sang de cordon humain
Recrutement
Cette étude était une étude imbriquée dans une étude plus vaste portant sur la vaccination maternelle contre la coqueluche. Il s’agissait d’une étude opportuniste utilisant des échantillons provenant des mêmes individus et non spécifiquement conçue pour examiner les questions. Des femmes enceintes en bonne santé ont été recrutées avant la naissance. Les critères d’exclusion comprenaient : la grossesse gémellaire, l’infection maternelle, la pathologie maternelle chronique, la pathologie de la grossesse et les bébés présentant des anomalies chromosomiques ou structurelles. L’étude a été approuvée par le National Research Ethics Service (NRES), NHS, Royaume-Uni (REC 13/LO/1712) et stockée dans la banque de tissus médicaux de l’Imperial College (ICHTB). Un consentement éclairé écrit a été obtenu.
Prélèvement d’échantillons de sang
Le sang de cordon et le sang maternel ont été collectés dans des tubes Vacutainer anticoagulés à l’héparine de sodium (BD Biosciences). Le sang de cordon a été obtenu à partir de cordons de nouveau-nés en bonne santé à la maternité de l’hôpital St Mary de Londres. Grâce à la collaboration avec le Dr Beth Holder et le professeur Beate Kampmann (Département de pédiatrie, Imperial College London), tous les participants avaient rempli un consentement éclairé écrit et l’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la Faculté de médecine de l’Imperial College London. Des échantillons de sang de femmes non enceintes ont également été prélevés à titre de comparaison. Ces échantillons de sang ont été obtenus auprès de volontaires du Département des maladies infectieuses. Des échantillons de sang maternel ont été prélevés auprès des mères au moment ou dans les 2 jours suivant l’accouchement. Des échantillons de sang de cordon ombilical ont été prélevés à l’accouchement.
Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)
Les échantillons de sang ont été traités au plus tard 8 heures après la naissance. Les échantillons de sang ont été dilués avec du PBS dans un rapport de 1:2. Ce mélange a ensuite été recouvert d’un volume égal d’Histopaque (densité : 1,077 g/mL, Sigma-Aldrich) et centrifugé à 1 000 tr/min pendant 20 min sans frein. La couche d’interphase trouble, qui contient les PBMC, a été collectée avec une pipette Pasteur dans un nouveau tube Falcon. Les PBMC ont ensuite été lavées avec 15 ml de PBS et centrifugées à 1 750 tr/min pendant 10 minutes avec frein activé. Le surnageant a été jeté et le lavage a été répété avec 15 ml de PBS pour éliminer les plaquettes. Après le deuxième lavage, le surnageant a été jeté et 2 ml de tampon ACK ont été ajoutés pour remettre le culot en suspension et éliminer tous les globules rouges contaminants. Après une incubation à température ambiante pendant 5 minutes maximum, 10 ml de milieu R10 ont été ajoutés et centrifugés pendant 5 minutes à 1 750 tr/min. Le culot a été remis en suspension avec R10, prêt à être compté.
Stimulation par le virus de la grippe/RSV des PBMC (échantillons de sang de cordon, de mère et de femme non enceinte)
Des PBMC provenant d’échantillons de sang de cordon ombilical, de mères et de femmes non enceintes ont été isolées. Au total, 2 × 105 cellules PBMC ont été incubées avec le virus de la grippe ou le RSV à MOI 3 sur une plaque à fond en U de 96 puits. Les échantillons ont été incubés pendant 24 heures à 37 °C (5 % de CO2) avant de récolter 200 µL de surnageant dans des tubes Eppendorf et stockés à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
Test Luminex
Statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans Graph Pad Prism V9 (GraphPad Software, San Diego, CA), R version 3.5.0. Une différence statistiquement significative a été définie comme P.-valeur
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