Dans une étude récente publiée dans la revue Natureles chercheurs ont présenté la structure moléculaire du transporteur de dopamine (DAT) complexé à la cocaïne.
La cocaïne est hautement addictive et son usage abusif peut aggraver les troubles psychiatriques. Bien qu’elle exerce des effets en se liant aux transporteurs de monoamine, son inhibition de DAT est à la base de ses propriétés addictives et gratifiantes. Actuellement, il n’existe pas de structures expérimentales de DAT humain (hDAT). Néanmoins, des informations provenant d’homologues, tels que les membres de la famille des transporteurs de soluté 6 (SLC6) et Drosophile mélanogaster DAT (dDAT) a fourni des informations structurelles.
Étude: Structure du transporteur de dopamine humain en complexe avec la cocaïneCrédit photo : Naeblys / Shutterstock
Ces résultats révèlent une architecture commune de 12 hélices transmembranaires (TM1–TM12) dans un repli pseudo-symétrique (le repli LeuT), avec le site de liaison au substrat au cœur. Chez tous les membres de la famille SLC6, le site central de liaison au substrat est accessible depuis la face membranaire intracellulaire ou extracellulaire, l’énergie pour le transport du substrat provenant du co-transport des ions sodium (Na+). Bien que beaucoup dépendent également des ions chlorure (Cl-), on ne sait pas encore si Cl- est lié/transporté.
La liaison de Cl- dans le DAT peut réduire de manière allostérique l’affinité du deuxième site sodium (Na2). Le site Na2 peut être nécessaire à l’isomérisation du transporteur vers un état orienté vers l’intérieur avant la libération du substrat, qui passe ensuite à une conformation ouverte vers l’extérieur. Dans le complexe dDAT-cocaïne, la cocaïne se lie au site central de liaison du substrat. Cependant, le dDAT présente une homologie de séquence plus élevée avec le transporteur de noradrénaline humaine (hNET) qu’avec le hDAT.
L’étude et les résultats
Dans la présente étude, les chercheurs ont réalisé une reconstruction par cryomicroscopie électronique (cryo-EM) de hDAT lié à la cocaïne. Tout d’abord, les cellules Expi293F ont été utilisées pour exprimer le hDAT marqué Twin-Strep (hDATTwin), qui a été purifié dans des micelles de glycodiosgénine (GDN). Le marqueur a réduit l’absorption globale de dopamine, indiquant que hDATTwin avait une expression plus faible que le hDAT de type sauvage lorsqu’il était exprimé de manière transitoire dans les cellules COS7.
Ensuite, la structure de hDATTwin liée à la cocaïne a été résolue à l’aide de la cryo-EM à une résolution de 2,66 Å. Elle avait une conformation ouverte vers l’extérieur avec les 12 TM formant le pli LeuT. Les TM 11 et 12 étaient situés à l’extérieur du domaine central, avec TM12 presque plié à mi-chemin. La boucle extracellulaire 4 (EL4) formait une structure en épingle à cheveux, qui recouvrait en partie la sortie du site de liaison central (S1).
La structure globale ressemblait aux structures orientées vers l’extérieur du transporteur de sérotonine humain (hSERT) et du dDAT. Les chercheurs ont cherché à savoir si la procédure de purification affectait la structure globale. Ils ont ainsi mesuré la liaison à un analogue de la cocaïne et n’ont trouvé aucune différence entre ses affinités avec le hDAT lorsqu’il était exprimé dans des cellules COS7 ou purifié dans des micelles détergentes.
De même, les affinités pour la cocaïne n’étaient pas significativement différentes. Le hDATTwin a été reconstitué en protéo-liposomes avec un gradient de Na+ et l’absorption de dopamine en fonction du temps a été mesurée. L’absorption spécifique a été mesurée, indiquant que le hDATTwin pouvait adopter tous les états conformationnels nécessaires au transport du substrat, même après purification.
La cocaïne a inhibé l’activité de transport à une constante d’inhibition similaire à celle des cellules COS7. La molécule de cocaïne était située dans le noyau hDATTwin à l’intérieur de la distance d’interaction des résidus S1. Le site S1 a trois sous-sites (A – C). L’amine tertiaire dans le cycle tropanique de la cocaïne a formé une interaction ionique avec Asp79 dans le sous-site A. De plus, la cocaïne a engagé le sous-site B via son cycle benzénique, formant une interaction π–π bord à face avec Tyr156.
Trois molécules d’eau ont formé des liaisons hydrogène autour du cycle benzénique, dont deux sont absentes dans la structure dDAT. De plus, seuls les sites chlorure et Na2 ont été peuplés, tandis que le premier site sodium (Na1) a été soit effondré, soit jamais établi lors de la liaison à la cocaïne. Une différence entre les complexes hDATTwin -cocaïne et SERT porcin (pSERT)- et dDAT-cocaïne était la position de EL4.
Dans les complexes pSERT et dDAT, la boucle occupait une position similaire, mais dans le complexe hDATTwin, elle a été déplacée de 3,7 Å par rapport à TM1b avec un déplacement de 2,2 Å de Trp84 Cα. De plus, un manteau de densités non protéiques a été observé à l’interface entre la micelle de GDN et le complexe hDATTwin-cocaïne, ce qui n’a pas été rapporté pour les reconstructions cryo-EM du transporteur de monoamine. Ces densités étaient hétérogènes et étaient principalement présentes à la périphérie de hDATTwin.
Conclusions
Ensemble, les chercheurs ont résolu la structure cryo-EM du complexe hDAT-cocaïne à 2,66 Å. La structure était une conformation ouverte vers l’extérieur avec un Na+ présent dans le site Na2 et une densité correspondant à Cl- détectée dans le site chlorure. Notamment, la structure a été résolue sans utiliser de repères moléculaires, qui sont souvent utilisés dans la cryo-EM de petites protéines membranaires. Ces découvertes approfondissent la compréhension des propriétés stimulantes et addictives de la cocaïne et pourraient aider au développement de médicaments ciblés contre la dépendance.
2024-08-13 06:14:00
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