Les anticorps suivants ont été utilisés : anticorps de lapin contre CCDC28A (générés dans cette étude) IF et WB 1 : 1000, GFP (Invitrogen, A11122, 2339829) IF et WB 1 : 1000, GSK-3α/β (Cell Signaling Technology ; 5676T, 7) SI 1:1000 ; Anticorps de souris contre l’α-tubuline (Abcam, ab7291, GR3398636-5) IF et WB 1 : 2000, β-actine (Sigma-Aldrich ; A2228, 118M4829V) 1 : 2000 (WB) ; un anticorps de rat contre CETN1/2 (BioLegend ; 698602, B333787) IF 1 : 200 ; un anticorps de poulet contre SYCP345 IF et WB 1:3000.
Production d’anticorps
L’ADNc codant sur toute la longueur Ccdc28a a été cloné dans le vecteur pET28c+ (Millipore). La protéine recombinante marquée HIS a été exprimée dans E. coli Cellules BL21 (DE3), solubilisées dans un tampon contenant 600 mM de NaCl, 30 mM d’imidazole, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 0,1% de Triton X-100 et purifiées à l’aide de résine Ni-NTA (Qiagen). Les résines ont été lavées avec du NaCl 600 mM, de l’imidazole 30 mM, du Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) et du Triton X-100 à 0,1 %, et les protéines ont été éluées en utilisant du NaCl 600 mM, de l’imidazole 500 mM et du Tris-HCl 20 mM (pH 7.5) tampon. Les protéines recombinantes ont été dialysées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et utilisées pour immuniser les animaux. L’anticorps polyclonal contre CCDC28A a été purifié par affinité à l’aide de billes de Sepharose couplées à un antigène (GE Healthcare).
PCR par transcription inverse
L’ARN total a été isolé des tissus à l’aide d’un kit RNeasy Mini (Qiagen). Une transcription inverse utilisant 0,09 µg d’ARN total a été réalisée et les ADNc ont été générés par super mix de transcription inverse iScript (Bio-Rad). Les produits ont été amplifiés par dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, 35 cycles à 95 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 15 s et 72 ° C pendant 30 s en utilisant les amorces appropriées et l’ADN polymérase Taq standard (New England Biolabs). . Les amorces utilisées étaient : Ccdc28a-avant 5′- CTGCAGGCGTTTGGAAATGA − 3′, Ccdc28a-inverse 5′- CGTCTGCCAAGTGGCAGTTTC − 3′, Ccdc28b-avant 5′- AGAAACGGAGTCCTAAGCCC-3′, Ccdc28b-inverse 5′-CTCCTTGCCTGCTCTCTTGAA-3′, Gapdh-avant 5′- TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′, Gapdh -inverse 5′- GGCATGGACTGTGTGGTCATGA − 3′.
Analyse du transcriptome par séquençage d’ARN unicellulaire
Analyse histologique
Les testicules ont été fixés dans le fixateur de Bouin pendant 24 h à 20–25 °C, déshydratés en série et inclus dans des blocs de paraffine. Des tranches de 8 µm d’épaisseur ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine.
Test de motilité des spermatozoïdes
La queue de l’épididyme a été disséquée chez des souris adultes. Les spermatozoïdes ont été extraits de la queue de l’épididyme dans un milieu liquide tubaire humain (HTF) préchauffé (Sigma-Aldrich; MR-070-D) à 37 ° C. Le milieu de sperme incubé a ensuite été dilué au rapport final de 1: 500, et 10 µl ont été placés sur une chambre de comptage d’hémocytomètre amélioré Neubauer (Hecht Assistant) pour le comptage.
Coloration au colorant rouge MitoTracker
La queue de l’épididyme a été disséquée chez des souris adultes. Les spermatozoïdes ont été extraits de la queue de l’épididyme dans du HTF préchauffé (Sigma-Aldrich ; MR-070-D). MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen, M7512) a été ajouté à une concentration de travail de 200 nM et incubé pendant 10 min à 37 ° C dans l’obscurité. Cinq microlitres ont été placés sur une lame de verre recouverte d’une lamelle et incubés à 4 ° C pendant 5 min pour que les spermatozoïdes arrêtent de bouger. Les lames ont été observées et imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Immunocoloration des spermatozoïdes de la queue de l’épididyme
La queue de l’épididyme a été disséquée chez des souris adultes. Les spermatozoïdes ont été extraits de la queue de l’épididyme dans du PBS. Les cellules ont été placées sur une lame de verre et séchées à 37°C pendant 20 min. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10 minutes et lavées plusieurs fois avec du PBS. Pour l’immunomarquage, les lames ont été incubées avec des anticorps primaires dans du PBS contenant 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant une nuit par incubation avec les anticorps secondaires suivants pendant 1 h à 20-25 °C : Alexa 488 anti-lapin d’âne (1 : 500 ; A21206, 2376850 ; Invitrogen) et Alexa 594, anti-souris âne (1 : 500 ; A21203, 2352146 ; Invitrogen). Les lames ont été lavées avec du PBS et montées dans du milieu Vectashield avec du DAPI (Vector Laboratories).
Immunocoloration des spermatocytes
Les testicules ont été hachés avec une pince à tête plate dans du PBS, lavés plusieurs fois dans du PBS et remis en suspension dans un tampon hypotonique (Tris 30 mM (pH 7,5), citrate trisodique 17 mM, EDTA 5 mM, dithiothréitol (DTT) 2,5 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,5 mM. (PMSF) et saccharose 50 mM). Au bout de 10 minutes, l’échantillon a été centrifugé et le surnageant a été aspiré. Le culot a été remis en suspension dans du saccharose 200 mM. Après 10 minutes, des volumes égaux de tampon de fixation (1% de paraformaldéhyde et 0,15% de Triton X-100) ont été ajoutés. Les cellules ont ensuite été placées sur une lame de verre, fixées pendant 2 h à 20-25 °C et séchées à l’air. Pour l’immunomarquage, les lames ont été incubées pendant une nuit avec des anticorps primaires dans du PBS contenant 5 % de BSA, suivies d’une incubation avec les anticorps secondaires suivants pendant 1 h à 20-25 °C : âne anti-lapin alexa 488 (1 : 500 ; A21206, 2376850 ; Invitrogen), âne anti-souris Alexa 594 (1:500 ; A21203, 2352146 ; Invitrogen), chèvre anti-poulet Alexa 594 (1 :500 ; Invitrogen ; A78951) et âne anti-rat Alexa 594 (1 :500 ; A21209). , 1807726). Les lames ont été lavées avec du PBS et montées dans du milieu Vectashield avec du DAPI (Vector Laboratories).
Microscopie
Les images ont été obtenues à l’aide d’un microscope (Olympus IL-X71 Delta Vision; Applied Precision) équipé d’objectifs 100 × NA 1,40 et 60 × NA 1,42, d’une caméra (CoolSNAP HQ; Photometrics) et du logiciel d’acquisition softWoRx 7.2.1 (Delta Vision). Toutes les images acquises ont été traitées à l’aide de Photoshop 25.6.0 (Adobe).
Microscopie électronique à transmission (TEM) des spermatozoïdes épididymaires
Les spermatozoïdes ont été collectés dans la queue de l’épididyme et dispersés dans une solution saline équilibrée de Hanks (Sigma-Aldrich, H8264). Les échantillons ont été fixés dans un tampon cacodylate 100 mM contenant 2,5% de glutaraldéhyde et 4% de paraformaldéhyde (pH 7,2) pendant 2 h à 20–25 °C. Les spermatozoïdes fixés ont ensuite été agglomérés à 1 000 tr/min, rincés deux fois avec le même tampon cacodylate et stockés dans le tampon jusqu’à la suite du traitement. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du tampon cacodylate et granulés après chaque lavage. La post-fixation a été réalisée avec du tétroxyde d’osmium à 1% pendant 1 h à 20-25 ° C. Ensuite, les échantillons ont été lavés quatre fois avec du tampon cacodylate à 4 °C. La coloration préalable à l’inclusion a été réalisée avec de l’acétate d’uranyle à 1% pendant 1 heure à 4 ° C, lavée deux fois avec de l’eau distillée et déshydratée à l’aide d’une solution d’éthanol graduée. Les échantillons de sperme granulés ont été incubés deux fois avec de l’oxyde de propylène pendant 10 minutes à 20-25 °C. Les échantillons ont été incorporés dans de la résine Embed 812 (EMS #14120) et polymérisés pendant 48 h à 60 °C. Des coupes ultrafines, d’environ 60 nm d’épaisseur, ont été collectées sur des grilles de cuivre recouvertes de résine Formvard (Ted Pella) (Gilder Grids Standard Square Mesh, EMS). Les coupes ont été contrastées pendant 20 min avec de l’acétate d’uranyle pendant 10 min et du citrate de plomb avant examen au microscope électronique à transmission à 100 kV (Jeol 1010). Ce protocole de préparation détaillé a assuré une visualisation de haute qualité des structures des spermatozoïdes épididymaires, permettant une analyse ultrastructurale précise à l’aide de TEM.
Expression de protéines exogènes dans le testicule
L’ADN plasmidique a été électroporé dans des testicules de souris vivantes en utilisant une technique d’électroporation in vivo35. En bref, les souris mâles de PD26 ont été anesthésiées avec de la kétamine-xylazine et les testicules ont été retirés de la cavité abdominale. L’ADN plasmidique (10 µl de solution à 5 µg/µl) a été injecté dans chaque testicule à l’aide de capillaires en verre sous un stéréomicroscope (M165C ; Leica). Les testicules ont été maintenus entre une paire d’électrodes de type pince (CUY21; BEX) et des impulsions électriques ont été appliquées quatre fois et quatre fois dans le sens inverse à 35 V pendant 50 ms pour chaque impulsion. Les testicules ont ensuite été renvoyés dans la cavité abdominale et la paroi abdominale et la peau ont été fermées avec des sutures. Les testicules ont été retirés 24 heures ou 13 jours après l’électroporation et une immunocoloration a été réalisée.
Criblage de levures à deux hybrides
Le criblage de deux hybrides de levure a été réalisé en utilisant Hybrigenics Services (Paris, France). La séquence codante de Mus musculus Ccdc28a (aa 1-184) a été amplifié par PCR et cloné dans pB27 sous forme de fusion C-terminale avec le domaine de liaison à l’ADN LexA (N-LexA-Ccdc28a-C). La construction a été confirmée par séquençage et utilisée comme appât pour cribler une bibliothèque d’ADNc de testicule de souris (Mouse Testis_RP1). Au total, 115 millions de clones ont été identifiés.
Quantification et analyse statistique
Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de GraphPad Prism (version 10.1.0) et de Microsoft Excel (16.89.1). Aucune méthode statistique formelle n’a été appliquée pour prédéterminer la taille des échantillons, qui ont été sélectionnés sur la base des conventions en vigueur dans le domaine et sont cohérents avec les tailles d’échantillon utilisées dans des études comparables. Pour les comparaisons de deux groupes, le test t bilatéral de Student a été utilisé (Figs. 1F et 2B, D et G). Les détails statistiques de chaque expérience sont fournis dans les légendes et les figures correspondantes.
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