Le pérampanel atténue le stress oxydatif et la pyroptose suite à une hémorragie sous-arachnoïdienne via la voie SIRT3/FOXO3α

Modèles SAH

Cette étude a été réalisée conformément aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Le comité d'éthique du 904ème hôpital du PLA de l'école clinique de Wuxi de l'université médicale d'Anhui a approuvé tous les protocoles expérimentaux. Des rats Sprague – Dawley mâles adultes, pesant 280 à 320 g, ont été obtenus auprès du Hangzhou Medical College. Les rats ont été construits pour le modèle SAH par perforation endovasculaire et en suivant le protocole de notre étude précédente.²⁰. Et 5 % d'isoflurane (RWD, Guangdong, Chine) dans le Nord₂S/S₂ Un mélange (1: 1) a été utilisé pour anesthésier les rats, suivi de 2,5% d'isoflurane avec un N₂S/S₂ (1:1) masque facial mélangé pour maintenir l’anesthésie. Le groupe fictif a été constitué selon la même procédure, sans ponction endovasculaire.

Conception expérimentale et groupes d'animaux

Conception expérimentale

Expérience 1 Pour vérifier l'effet neuroprotecteur du pérampanel, 48 rats (68 rats ont été soumis à une intervention chirurgicale, dont 20 rats éliminés pour cause de décès ou de grade SAH ≤ 7) ont été répartis au hasard en 3 groupes : groupe fictif, groupe SAH et groupe SAH + Par, avec 16 rats dans chaque groupe (comme le montre la figure 1, expérience 1). 8 rats de chaque groupe ont été utilisés pour évaluer les scores neurologiques (le score de Garcia modifié et le test de balance du faisceau), tandis que 6 ont été utilisés pour mesurer la teneur en eau du son (BWC). De plus, 4 rats étaient dans chaque groupe pour la détection de la coloration FJB et 6 rats pour le test Western blot (WB) des altérations de SIRT3 et FOXO3α. De plus, 6 rats (partagés avec le test WB) ont été utilisés pour ELISA afin de déterminer les modifications des facteurs inflammatoires IL-1β et IL-18. Les tests ont débuté 24 heures après une modélisation réussie.

Expérience 2 Explorer si le pérampanel supprime le stress oxydatif et la pyroptose induite par NLRP3 en déclenchant la voie de signalisation médiée par SIRT3. 64 rats (86 rats ont été soumis à une intervention chirurgicale, dont 22 rats éliminés en raison de leur décès ou d'un grade SAH ≤ 7) ont été répartis au hasard en quatre groupes : simulacre, SAH, SAH + Per (5 mg/kg) et SAH + Per + 3. -TYP (50 mg/kg), avec 16 rats dans chaque groupe (comme le montre la figure 1, expérience 2). Pour l'évaluation du score neurologique, 8 rats ont été utilisés ; pour la teneur en eau du cerveau, 6 rats ont été utilisés ; pour la coloration FJB et la coloration par immunofluorescence (IF), 4 rats ont été utilisés ; pour le Western blot, 6 ont été utilisés. De plus, 6 rats (partagés avec le test WB) se trouvaient dans chaque groupe pour la mesure des niveaux de ROS, et 6 rats (partagés avec le test WB) ont été utilisés pour l'ELISA. Les tests ont débuté 24 heures après une modélisation réussie.

Groupes d'animaux

Les rats du groupe Sham ont subi une opération simulée, avec un prétraitement du véhicule. Les rats du groupe SAH ont subi l'opération SAH, avec prétraitement du véhicule. Les rats du groupe SAH + Per ont subi l'opération SAH, avec prétraitement pérampanel/véhicule. Les rats du groupe SAH + Per + 3-TYP ont été soumis à l'opération SAH, avec un prétraitement pérampanel/3-TYP.

Administration de médicaments

Le parampanel (Weicai, Chine) a été pris par voie orale à une dose de 5 mg/kg 2 h avant SAH ictus. Avant la modélisation, des volumes égaux de 3-TYP (50 mg/kg) et de véhicule (1 % d'éthanol) ont été administrés par voie intrapéritonéale (ip), à raison d'une dose tous les deux jours, pour un total de trois doses. Les schémas posologiques du pérampanel et du 3-TYP étaient basés sur des études antérieures^9,21.

Évaluation du score neurologique

La fonction neurologique du rat a été évaluée 24 heures après l'HSA, sur la base du système de notation de Garcia modifié et du test d'équilibre du faisceau, par deux observateurs aveugles à l'étude.²². En bref, le test de Garcia modifié comprend six sous-tests. Les trois sous-tests de mouvement spontané, de symétrie du mouvement des membres et d'étirement des membres antérieurs sont notés de 0 à 3, tandis que les trois autres tests, capacité d'escalade, proprioception corporelle et réponse au toucher des vibrisses, ont été notés sur une échelle de 1 à 3. ce qui a donné un score total allant de 3 à 18. Le test de balance à poutre a été réalisé pour évaluer la capacité de marche des rats en une minute sur une poutre en bois de 15 mm de large. Le score moyen a été calculé en fonction de la capacité de marche de trois scores consécutifs de 0 à 4. Plus le score est élevé, meilleure est la fonction neurologique.

Classe SAH

La gravité de l'HSA a été définie par un observateur distinct, aveugle à l'expérience, en utilisant le grade de l'HSA comme indiqué précédemment.⁵. En bref, le score varie de 0 à 18 dans ce système de notation basé sur la taille du caillot sanguin. La base des rats a été sectionnée en 6. Chaque section a été notée comme suit : aucune hémorragie sous-arachnoïdienne enregistrée comme 0, hémorragie sous-arachnoïdienne minime enregistrée comme 1, volume sanguin modéré avec artères visibles enregistré comme 2 et caillots bloquant toutes les artères enregistrés comme 3. Les rats avec des scores inférieurs à 8, indiquant une légère SAH, ont été exclus.

Teneur en eau du cerveau

Après anesthésie et décapitation, les cerveaux de rats ont été rapidement retirés 24 h après la SAH et le poids humide a été immédiatement obtenu. Ensuite, les cerveaux ont été séchés pendant 24 h à 105 ℃ et le poids sec a été obtenu. La teneur en eau du cerveau a été déterminée comme suit :[(wet weight − dry weight)/wet weight]× 100 %.

Coloration à l'hématoxyline-éosine (HE)

La coloration HE a été réalisée pour observer la morphologie pathologique du tissu cérébral, selon un protocole décrit précédemment²⁰. Les rats ont été soumis à une perfusion transcardiaque avec 500 ml de solution de fixation tissulaire à 4% (P1110, Solarbio, Chine) 24 h après SAH. Après plus de 24 heures de fixation, le tissu cérébral du rat a été déshydraté et inclus dans de la paraffine pour réaliser une coupe coronale continue d'une épaisseur de 4 à 6 µm. Les coupes de cerveau de rat décirées ont été colorées avec une coloration HE de routine, observées au microscope optique et photographiées.

Coloration par immunofluorescence (IF)

SI la coloration a été réalisée comme décrit précédemment²². Le tissu cérébral du rat a été déshydraté et inclus en paraffine pour réaliser des coupes en paraffine. Sectes de tissus cérébraux inclus en paraffine. (4 ~ 6 µm d'épaisseur) ont été chauffés avec une solution de réparation d'antigène citrate EDTA (P0086, Beyotime, Chine), dans un four à micro-ondes pendant 30 min. Les coupes ont ensuite été scellées à température ambiante pendant 30 min avec 5 % de sérum de chèvre (SL038, SolarBioLife Science, Chine) et incubées toute la nuit à 4 ℃ avec les anticorps primaires suivants : anticorps anti-GSDMD (1:50, ab15515, Abcam) et anticorps anti-NeuN (1: 500, ab104224, Abcam). Ensuite, les coupes ont été rincées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), suivies d'une incubation avec les anticorps secondaires appropriés. Après lavage avec du PBS, les noyaux ont été colorés pendant 15 minutes avec du 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Sigma Aldrich, USA). La capture des images a été réalisée sur un microscope à fluorescence (Leica, DMI8, Allemagne).

Coloration FJB

Le degré de lésion neuronale dans le cortex cérébral temporal ipsilatéral (droit) a été évalué par coloration FJB qui peut identifier les neurones dégénératifs. Selon une méthode précédente²², le tissu cérébral du rat a été transformé en coupes de paraffine comme décrit ci-dessus, et les coupes de paraffine ont été traitées avec du xylène, combiné avec un gradient d'éthanol. La solution de coloration FJB préparée (Sigma‒Aldrich, États-Unis) a été utilisée pour incuber les coupes à température ambiante pendant 20 min. Ensuite, les noyaux ont été teints avec du colorant DAPI pendant 10 minutes et rincés à l’eau pure. Après séchage à l'air, les tranches ont été placées dans du xylène pendant 2 min, puis scellées avec de la résine neutre. Enfin, des images du cortex temporal homolatéral ont été collectées par microscopie à fluorescence (Leica, DMI8, Allemagne). Les statistiques et l'analyse des neurones FJB (+) ont été réalisées en aveugle.

Mesure des niveaux de ROS

La production de ROS a également été mesurée par le kit ROS Assay (Nanjing Jiancheng, E004-1-1, Chine) conformément aux instructions du fabricant.⁷. La teneur en ROS dans les tissus cérébraux a été évaluée en intensité de fluorescence/mg de protéine.

ELISA

Les niveaux de facteurs pro-inflammatoires, notamment IL-1β et IL-18, ont été détectés par un kit de test IL-1β et un kit de test IL-18. Le niveau de l'indice de dommages oxydatifs cérébraux, y compris le malondialdéhyde (MDA), a été analysé à l'aide d'un kit de test MDA en suivant les instructions du fabricant. Les niveaux de facteurs antioxydants, notamment l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et de la glutathion peroxydase (GSHPx), ont été mesurés respectivement à l'aide des kits commerciaux (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Chine), conformément aux instructions du fabricant. Le FOXO3α acétylé (Ac-FOXO3α) a été mesuré par un kit de test Acetyl-FOXO3α (JCL005, Chine) pour les rats.

Western blot

Le Western blot a été réalisé comme décrit précédemment²⁰. Tout d’abord, le lysat RIPA (Beyotime, Chine) a été utilisé pour l’extraction des protéines du cortex cérébral du rat, puis la concentration en protéines entre les groupes a été déterminée par la méthode BCA (Beyotime, Chine). Trente microgrammes de protéine totale ont été chargés dans chaque groupe et le même volume de tampon d'échantillon 2X Laemmli a été ajouté. Ensuite, les échantillons ont été bouillis (5 min) pour dénaturer la protéine. La protéine bouillie a été transférée du gel sur une membrane PVDF (Millipore, États-Unis), après électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. Ensuite, la membrane a été bloquée et incubée avec un anticorps primaire correctement dilué dans un tampon de blocage à 4 ° C pendant la nuit. La membrane a été lavée avec du TBST trois fois (5 minutes à chaque fois), suivie d'une incubation avec l'anticorps secondaire dilué recommandé conjugué à la HRP pendant 1 heure à température ambiante. La membrane a ensuite été lavée trois fois avec un détergent TBST pendant 5 minutes à chaque fois. Enfin, les transferts ont été visualisés par un kit ECL (Beyotime, Chine) et quantifiés à l'aide du logiciel ImageJ (National Institutes of Health, USA). Les anticorps primaires comprenaient les anti-SIRT3 (1 : 1 000, Ab246522, Abcam) ; anti-FOXO3α (1: 1000, AF6020, Affinity); anti-CAT (1: 2000, 66765-1-Ig, Proteintech); anti-MnSOD (1:10 000, 66474-1-Ig, Proteintech) ; anti-NLRP3 (1: 1000, DF7438, Affinité); anti-ASC (1: 1000, DF6304, Affinité); caspase 1 anti-clivée (1: 1000, AF4022, Affinity); anti-N-GSDMD (1: 1 000, A22523, ABclonal); et anti-β-actine (1: 1000, AF7018, Affinity).

analyses statistiques

Le logiciel GraphPad Prism (8.0, San Diego, Californie, États-Unis) a été utilisé pour l'analyse statistique. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart type (SD). Après le test de normalité, les données entre deux groupes ont été comparées à l'aide du test t de Student, tandis que les différences entre plusieurs groupes ont été analysées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey. Une valeur AP inférieure à 0,05 a été considérée comme indiquant une différence significative.

Déclaration

Nous déclarons que cette étude a été réalisée conformément aux directives ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments).