Culture de cellules
MC38, une lignée cellulaire de carcinome du côlon de souris d’origine C57BL/6, a été obtenue auprès de Kerafast (#ENH204, RRID : B288). Les cellules MC38 ont été maintenues dans du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec une concentration élevée de glucose (25 mM) additionnée de 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de 4-(2 -acide hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES), 50 unités/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine. Les cellules MC38 ont été cultivées avec des concentrations faibles en glucose (5 mM) ou élevées en glucose (25 mM) pendant 14 jours (LG-MC38 et HG-MC38).
Souris
Des souris mâles C57BL/6J ont été achetées chez Charles River Laboratories (Yokohama, Japon) et utilisées pour des expériences à l’âge de 7 semaines. Toutes les souris ont été maintenues comme décrit précédemment37. Des souris diabétiques induites par la STZ ont été créées par une administration intrapéritonéale unique de 150 mg/kg de STZ (Sigma-Aldrich) dilué avec 0,09 M de CB au jour -7. Les souris témoins ont reçu une seule administration intrapéritonéale de 0,09 M de CB comme véhicule au jour -7. Les niveaux de glucose ont été mesurés dans le sang des veines de la queue par un système de mesure du glucose de base à une touche validé (Glutest mint, Sanwa Kagaku Kenkyusho CO., LTD.). Le poids corporel a été mesuré aux jours -7, 0, 5, 8 et 14. Si la glycémie était < 300 mg/dl 2 jours après la première administration de STZ (jour -5), les souris ont été réadministrées avec la même dose de STZ par voie intrapéritonéale. Souris montrant des niveaux de glucose dans le sang3 g de la ligne de base ont été exclus des analyses. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’École supérieure de médecine de l’Université de Nagoya et effectuées conformément aux directives institutionnelles conformes aux directives de protection des animaux des National Institutes of Health. L’étude a été réalisée conformément aux directives ARRIVE.
Test de croissance tumorale
Sept jours après l’administration intrapéritonéale de STZ ou de CB (jour 0), 1 × 106 Des cellules MC38 ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit des souris. Aux jours 5, 8 et 11, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d’anticorps de rat anti-souris PD-1 (200 μg/chacun) (#BE0146, clone : RMP1-14, Bio X Cell) ou d’IgG de rat normal (#147- 09521, WAKO) comme témoin. Diamètres des tumeurs (mm2) ont été mesurés au pied à coulisse aux jours 5, 8, 11 et 14, puis les volumes tumoraux (mm3) ont été calculés selon la formule suivante : volume =[length (mm) × width2 (mm)]/6. Au jour 14, des tissus tumoraux et des dLN ont été obtenus de toutes les souris. Un dLN dans le tissu sous-cutané du flanc droit a été confirmé en détectant le flux de colorant 24 h après l’injection de 0, 4% de bleu trypan dans la tumeur MC38 (Fig. S9 supplémentaire). La dose d’anticorps anti-PD-1 a été déterminée sur la base d’études antérieures38,39.
Immunohistochimie
Les tumeurs MC38 et les dLN obtenus à partir de souris au jour 14 ont été traités avec le fixateur de zinc de Beckstead40 puis traité comme décrit précédemment41. Les tissus fixés ont été coupés en sections de 4 µm et colorés par immunohistochimie (#CTS017, R&D Systems) ou coloration par immunofluorescence, comme décrit précédemment42,43. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés dans cette étude ; anti-CD4 (#HS-360 004, Synaptic Systems), anti-CD8a (#14-0808-82, Invitrogen), anti-CD11c (#ab52632, Abcam, #14-0114-82, Invitrogen), anti-CCR1 (#NBP1-78173, NOVYS Biologicals), anti-CCR2 (#ab273050, abcam) et anti-CXCL9 (#AF-492, R&D Systems). L’immunofluorescence a été observée avec un microscope à fluorescence (BZ-9000 ou BZ-X800, Keyence).
Compte les cellules infiltrant la tumeur
Des images prises au microscope optique ont été utilisées pour compter le nombre de CD4 infiltrant la tumeur+CD8+et CD11c+ cellules. Des images de cinq champs indépendants de tissu tumoral MC38 (grossissement 200×) ont été utilisées pour compter les CD4 infiltrant la tumeur+ et CD8+ cellules. Des images de la zone marginale de la tumeur MC38 avec les cellules positives les plus abondantes (grossissement 200×) ont été utilisées pour compter les CD11c infiltrant la tumeur+ cellules.
Cytométrie en flux
Des suspensions unicellulaires ont été obtenues à partir des dLN de souris, comme décrit précédemment. Les cellules ont été rincées avec du PBS et incubées avec un bloc Fc (#101320 et #422302, BioLegend) pendant 10 min à 4 °C pour diminuer le signal de fond. Après lavage, les cellules ont été colorées avec anti-CD3 (#100203, BioLegend), anti-CD4 (#116019, BioLegend), anti-CD8 (#100750, BioLegend), anti-CD44 (#103007, BioLegend), anti-CD62L (#104418, BioLegend) et anti-PD-1H (#143715, BioLegend) pendant 15 min à 4 °C, et une coloration Live/Dead (#65-0866, Invitrogen) pour exclure les cellules mortes. Toutes les données des analyses de cytométrie en flux (LSR Fortessa X-20, BD Biosciences) ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo (BD Biosciences). Dans les expériences de cytométrie en flux, des comptages totaux allant jusqu’à 300 000 ont été analysés dans la plupart des échantillons.
qRT-PCR
L’ARN total a été extrait des dLN et des tissus tumoraux de souris et de cellules MC38 cultivées (kit RNeasy, Qiagen)41. L’ADNc a été synthétisé à partir de 500 ng d’ARN total à l’aide du kit ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). Les réactions qRT-PCR ont été réalisées à l’aide de Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Agilent Technologies), et les échantillons ont été analysés à l’aide de CFX Connect (Bio-Rad). GAPDH a été utilisé comme contrôle interne pour évaluer les niveaux relatifs d’ARNm, qui ont été calculés à l’aide de la méthode Ct comparative, comme décrit précédemment41. Les séquences d’amorces utilisées étaient : CXCL9, sens : 5′-CCGAGGCACGATCCACTAC, sens inverse : 5′-CCGGATCTAGGCAGGTTTG ; CCR6, avant : 5′-TTGTCCTCACCCTACCGTTC, arrière : 5′-GATGAACCACACTGCCACAC ; PD-L1, avant : 5′-GCGGACTACAAGCGAATCAC, arrière : 5′-CTCAGCTTCTGGATAACCCTCG ; GAPDH, vers l’avant : 5′- TGCACCACCAACTGCTTAG, vers l’arrière : 5′- GGATGCAGGGATGTTC.
RT2 profileur PCR array
La RT2 Matrice PCR ProfilerTM (#PAMM-022Z, QIAGEN, https://geneglobe.qiagen.com/us/product-groups/rt2-profiler-pcr-arrays) a été utilisé pour examiner les niveaux d’expression d’un panel de 84 gènes de chimiokines ou de récepteurs de chimiokines. L’ARN total a été extrait des cellules MC38 (LG-MC38 et HG-MC38), des dLN et des tissus tumoraux de souris (n = 3–4/groupe), puis transcrit en ADNc. Les niveaux d’expression de 84 gènes ont été analysés selon les instructions du fabricant. Les changements de pli dans l’expression des gènes ont été analysés à l’aide de l’outil d’analyse en ligne du centre d’analyse de données GeneGlobe (https://dataanalysis2.qiagen.com/pcr). Les gènes avec des valeurs CT supérieures à 30 ont été exclus.
analyses statistiques
Dans toutes les expériences, nous avons d’abord testé la normalité avec le test de Shapiro-Wilk. Lorsque la population suivait une distribution normale, le test t de Student bilatéral a été utilisé pour comparer deux groupes, et l’ANOVA unidirectionnelle et le test de Tukey ont été utilisés pour comparer plusieurs groupes. Lorsque la population ne suivait pas une distribution normale, le test Mann-Whitney U a été utilisé pour comparer deux groupes, et les tests Kruskal-Wallis et Mann-Whitney U avec correction de Bonferroni ont été utilisés pour comparer plusieurs groupes. Les données graphiques sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. Dans les tracés en boîte et à moustaches, les cases indiquent les valeurs médianes avec l’intervalle interquartile et les moustaches indiquent les valeurs les plus basses et les plus élevées. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif dans tous les cas. Les analyses statistiques ont été réalisées avec IBM SPSS Statistics V.28.
