Préparation animale
Tous les protocoles et procédures chirurgicales ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), l’Université de Houston Animal Care Operations (ACO), ont été effectués conformément aux directives et réglementations acceptées (code de protocole 16-017 et date de approbation : 10 juillet 2019) et ont été menées conformément aux directives ARRIVE. Des rats Sprague-Dawley femelles gravides (Charles River, Wilmington, MA, États-Unis) reçoivent l’ordre d’arriver le jour de gestation 4 et sont livrés aux opérations de soins aux animaux de l’Université de Houston. Au 7e jour de gestation, 72 h après l’arrivée, une pompe osmotique (Alzet, Cupertino, CA, USA) est implantée en sous-cutané contenant soit du tartrate hydrogéné de nicotine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) libéré à raison de 6 mg /kg/jour ou un volume égal de véhicule salin pour le contrôle. Les concentrations de nicotine implantées dans la pompe osmotique sont calculées en fonction du poids du rat adulte. La nicotine est ensuite libérée via une pompe osmotique et transmise aux chiots du 7e jour de gestation au 14e jour postnatal pendant la grossesse et par l’allaitement. Des pompes osmotiques remplies de solution saline sont utilisées comme contrôle. Les animaux sont observés et pesés quotidiennement alors qu’ils sont maintenus dans l’installation ACO avec un programme de 12 h de lumière/12 h d’obscurité à une température de 22 ± 2 °C et 65 % d’humidité. L’accès à la nourriture et à l’eau standard a été fourni.
Préparation des tranches
Pour mieux comprendre la distribution neuronale et le développement des neurones DA, GABA et glutamate après une exposition prénatale à la nicotine dans chaque sous-région de la VTA, des échantillons ont été prélevés 7 (P7), 14 (P14) et 21 (P21) jours après la naissance et ont été comparés à des groupes salins du même âge. Au jour postnatal approprié 7 (nicotine : n = 7 ; solution saline : n = 7), jour 14 (nicotine : n = 20 ; solution saline : n = 14) ou 21 (nicotine : n = 18, solution saline : n = 14 ), les chiots ont été regroupés au hasard et anesthésiés avec de l’isoflurane avant la décapitation. Les cerveaux ont été prélevés rapidement et sectionnés à l’aide d’un microtome à lame vibrante semi-automatique VT1200 (Leica, Nussloch, Eisfeld, Allemagne) à une vitesse de 0,5 mm/s. Des tranches de cerveau horizontales de la VTA ont été obtenues en coupant de la face ventrale du cerveau (1500 µm de profondeur) pour les âges P7, P14 et P21 avant que les échantillons de la sous-région VTA ne soient collectés. Pour les groupes P7, P14 et P21, des tranches de 300 µm d’épaisseur ont été collectées pour chacune des sous-régions PN, PIF et PBP de la VTA. Deux poinçons de biopsie de 1 mm (Integra Miltex, VWR, Radnor, PA, USA) ont été utilisés pour collecter bilatéralement les poinçons cérébraux VTA. Les échantillons de tissus ont été conservés frais dans du RNAlater (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA). Des tranches de cerveau de chaque sous-région ont été prélevées et des échantillons ont été collectés. Leur expression génique relative a été analysée à l’aide des amorces pour qPCR répertoriées dans le tableau 1.
Extraction d’ARN et préparation d’ADNc
L’ARN total est isolé à l’aide du kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) après pilonnage de l’échantillon de tissu dans un tampon RLT et une solution de bêta-mercaptoéthanol (Sigma Life Science, Darmstadt, Allemagne) et tamisage de l’échantillon à travers une seringue de calibre 20 ( Air-Tite Products Co., Inc., Virginia Beach, VA) dix fois. Ensuite, l’ADNc est préparé à l’aide du kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) conformément aux instructions du fabricant et réalisé sur un thermocycleur T100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) avec un volume final de 20 μL suivant les paramètres : 25 °C pendant 10 min, 37 °C pendant 2 h, 85 °C pendant 5 min. Toutes les réactions ont été réalisées en triple exemplaire avec un témoin sans matrice (NTC).
qPCR
Les directives MIQE ont été suivies pour concevoir l’étude qPCR. Amorces du test d’expression génique Taqman, comme indiqué dans le tableau 1, GAD1 (ID de test : Rn00690300_m1) et GAD2 (ID de test : Rn00561244_m1) pour le GABA, Slc6a3 (ID de test : Rn00562224_m1) et Th (ID de test : Rn00562500_m1) pour la dopamine et Slc17a6 (ID d’essai : Rn00584780_m1) pour la dopamine et le glutamate sont effectués en triple dans chaque échantillon de sous-région. GAPDH (Assay ID : Rn01775763_g1) sert de gène de référence et est également réalisé en triple exemplaire pour chaque échantillon. TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) est utilisé avec les tests associés suivants : 2 min à 50 °C, 2 min à 95 °C, 40 cycles à 1 s à 95 °C et 20 s à 60 °C sur le système de PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). La méthode Ct comparative (ΔΔCt) a été calculée à l’aide du système de PCR en temps réel StepOnePlus, en comparant l’échantillon salin de GAPDH et utilisée pour déterminer les valeurs d’expression relatives. Des réactions RT-qPCR en triple ont été réalisées dans toutes les expériences de validation.
analyses statistiques
L’analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA), y compris les degrés de liberté du test F. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’une analyse de variance bidirectionnelle à mesures répétées (ANOVA) suivie de l’analyse post-hoc de Tukey. Des tests t non appariés avec correction de Welch ont été utilisés lors de la comparaison des profils d’expression génique entre les groupes de traitement à la nicotine et au sérum physiologique dans les sous-régions. Les informations statistiques ont été données sous la forme t = valeur t et p = valeur p. Les valeurs p Benjamini–Hochberg du taux de fausses découvertes (FDR) ont été calculées pour corriger les tests multiples29. Les gènes avec FDR ajusté p < 0,05 ont été considérés comme exprimés de manière significativement différentielle. La taille des échantillons a été calculée à l'aide de calculs de puissance standard, nécessitant une taille d'effet de 30 % à une puissance de 80 %. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne arithmétique ± erreur standard de la moyenne (SEM). Tout au long du manuscrit, les répliques biologiques indépendantes sont définies comme des expériences réalisées indépendamment sur du matériel dérivé de différents animaux.
Protocole d’étude animale
Le protocole d’étude animale a été approuvé par l’Institutional Animal Care and use Committee (IACUC) et l’Université de Houston Animal Care Operations (ACO) (code de protocole 16-017 et date d’approbation : 10 juillet 2019).
