L’expression de LPAR4 médiée par SOX17 joue un rôle central dans le développement et la régénération cardiaques après un infarctus du myocarde

Isolement d’ARN

L’ARN total a été isolé à l’aide du réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). La qualité de l’ARN a été évaluée à l’aide de la puce RNA 6000 Nano (Agilent Technologies, Amstelveen, Pays-Bas) et d’un bioanalyseur Agilent 2100, tandis que la quantification de l’ARN a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Préparation de la bibliothèque et séquençage de l’ARNm entier

Pour les ARN de contrôle et de test, la construction de la bibliothèque a été réalisée à l’aide du kit de préparation de bibliothèque d’ARNm-Seq QuantSeq 3 ‘(Lexogen, Inc., Vienne, Autriche) conformément aux instructions du fabricant. En bref, 500 ng d’ARN total ont été préparés et une amorce oligo-dT contenant une séquence compatible Illumina à son extrémité 5 ‘a été hybridée dans l’ARN pour initier la transcription inverse. Après dégradation de la matrice d’ARN, la synthèse du deuxième brin a été initiée à l’aide d’une amorce aléatoire contenant une séquence de liaison compatible Illumina à son extrémité 5 ‘. La bibliothèque double brin a été purifiée à l’aide de billes magnétiques. Par la suite, la bibliothèque a été amplifiée pour permettre l’ajout de séquences adaptatrices complètes nécessaires à la génération de grappes, suivie d’une purification. Le séquençage à haut débit (single-end 75) a été réalisé à l’aide de NextSeq 500 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

L’analyse des données

Les lectures d’ARNm-Seq QuantSeq 3′ ont été alignées à l’aide de Bowtie2 (Langmead et Salzberg, 2012). Les indices Bowtie2 ont été générés à partir de la séquence d’assemblage du génome ou des séquences de transcription représentatives pour l’alignement sur le génome et le transcriptome, respectivement. Le fichier d’alignement a été utilisé pour assembler les transcrits, estimer leur abondance et détecter l’expression différentielle des gènes. Les gènes exprimés de manière différentielle ont été déterminés sur la base des comptages d’alignements uniques et multiples en utilisant la couverture dans Bedtools (Quinlan AR, 2010). Les données du nombre de lectures (RT) ont été traitées sur la base de la méthode de normalisation globale à l’aide de Genowiz ™ version 4.0.5.6 (Ocimum Biosolutions, Telangana, Inde). La classification des gènes était basée sur des recherches effectuées à l’aide de DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) et bases de données Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Lignée de cellules iPS humaines (hiPSC)

Nous avons construit une lignée hiPSC en reprogrammant des cellules de fibroblastes de prépuce nouveau-nés (NuFF, GSC-3006G ; AMS Biotechnology (GlobalStem), Abingdon, Royaume-Uni) par transduction avec les quatre facteurs Yamanaka. La lignée hiPSC préparée a été cultivée sur une cellule nourricière STO (SIM, numéro ATCC® : CRL-1503™, Manassas, VA, USA).

Pcr en temps réel

L’ARN a été isolé et purifié à partir de cellules récoltées aux moments représentatifs à l’aide du mini kit RNeasy® (74104, Qiagen, Hilden, Allemagne) et de QIAshredder. Un mélange maître qPCR RT (FSQ-201, TOYOBO, Osaka, Japon) a été utilisé pour synthétiser l’ADNc à partir de l’ARN. Les séquences d’amorces sont présentées dans le tableau supplémentaire 1 des informations supplémentaires.

Western blot

Western blot a été réalisé pour confirmer les modèles d’expression protéique de MESP1 et SOX17 lors de la différenciation cardiaque dérivée de hiPSC : anti-MESP1 (sc-130461, Santa Cruz Biotechnology, TX, États-Unis), anti-SOX17 (AF1924, R&D Systems, Minneapolis, MN , USA) et anti-GAPDH (sc-47724, Santa Cruz Biotechnology, TX, USA). Trente microgrammes de protéine ont été transférés sur une membrane de nitrocellulose (IB23001, Thermo Fisher Scientific, Inc.) à l’aide d’un dispositif de transfert de gel iBlot 2 (IB21001, Thermo Fisher Scientific, Inc.). HRP-âne anti-IgG de souris (H+L) (715-035-151, Jackson ImmunoResearch, Philadelphie, PA, États-Unis) et HRP-âne anti-IgG de chèvre (H+L) (705-035-147, Jackson ImmunoResearch ) ont été utilisés comme anticorps secondaires.

Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Nous avons récolté des cellules de moelle osseuse (BM) à partir de BM, de tibias et de fémurs et les avons passées à travers un tamis cellulaire de 40 μm (352340, Corning, New York, États-Unis) pour obtenir des cellules individuelles. Nous avons également obtenu des cellules uniques de cœurs en les disséquant dans la plus petite taille possible à l’aide de ciseaux à dissection, en les incubant avec des enzymes de digestion cardiaque à 37 ° C pendant 1 h et en les passant à travers un tamis cellulaire de 70 μm (352350, Corning, New York , ETATS-UNIS). Des cellules individuelles isolées du BM et du cœur ont été incubées sur de la glace pendant 30 min avec les anticorps suivants pour l’analyse par cytométrie en flux : LPAR4 (PA549727, Thermo Fisher Scientific, Inc.), GFP (ab13970, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), CD45 (sc -53665, Santa Cruz Biotechnology) et Nkx2.5 (ab91196, Abcam).

Immunofluorescence (IF)

Les tissus cardiaques et hépatiques de souris ont été récoltés à des moments représentatifs par rapport à l’IM après une greffe de moelle osseuse (BMT) et intégrés dans des blocs de paraffine. Après sectionnement (4 μm), IF a été réalisée. Les tissus sectionnés ont été incubés avec les anticorps suivants : GFP (ab13970, Abcam), αSA (A2172, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), LPAR4 (PA549727, Thermo Fisher Scientific, Inc.), SOX17 (AF1924, R&D Systems), Sca1 (13-5981-28, Thermo Fisher Scientific, Inc.) et Nkx2.5 (ab91196, Abcam).

Immunohistochimie (IHC)

Les embryons de souris LPAR4_CreERT2_IRES_EGFP_TG ont été récoltés aux jours embryonnaires 10,5 et 12,5. Les embryons ont été fixés dans une solution de paraformaldéhyde à 4% (163-20145, Wako, Richmond, VA, USA) avant d’être inclus dans de la paraffine. Les échantillons d’embryons ont ensuite été sectionnés en morceaux de 4 μm d’épaisseur et déparaffinés. Les antigènes ont été récupérés par ébullition à 95 ° C dans du tampon Tris-EDTA, pH 9, 0 (ab93684, Abcam). Ensuite, les sections ont été lavées dans du PBS 1X et bloquées dans du BSA à 0,1 % avec du Triton X-100 à 0,1 % pendant 1 h. La GFP a été détectée à l’aide d’anticorps anti-GFP (ab13970, Abcam) à 4 ° C pendant la nuit. Des anticorps anti-IgY-peroxydase de poulet (A9046, Sigma-Aldrich) ont été utilisés comme anticorps secondaires et les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 90 min. Les coupes ont ensuite été développées avec le kit Pierce DAB Substrate (34002, Thermo Fisher Scientific, Inc.) à température ambiante pendant 10 min et contre-colorées avec de l’hématoxyline (03971, Sigma). Les images ont été acquises à l’aide d’un Nikon ECLIPSE Ci-L.

Dosage de la puce

Pour l’identification des sites de liaison MESP1 et SOX17, les séquences consensus de MESP1 et SOX17 ont été comparées à la séquence située à 3017 pb en amont du site d’initiation de la transcription LPAR4. Pour la réticulation cellulaire, du formaldéhyde à 1% (F8775, Sigma-Aldrich) a été ajouté à une boîte de culture cellulaire, fixé à 25 ° C pendant 10 min et collecté dans un tube. Le tampon ChIP RIPA (50 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, 0,5 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 0,1 % désoxycholate de sodium (SDC), 140 mM NaCl, 1 × cocktail inhibiteur de protéase (PIC)) a été ajouté au culot cellulaire. Pour le cisaillement de l’ADN, les deux fractions ont été soniquées 15 fois à l’aide d’un Bioruptor (30 s allumé/30 s éteint par cycle). L’ADN soniqué a été traité avec 2 μg chacun des anticorps MESP1 (sc-130461, Santa Cruz Biotechnology, TX, USA) et SOX17 (AF1924, R&D Systems) pendant la nuit. De la protéine A/G Sepharose (ab193262, Abcam) a été ajoutée pour extraire l’ADN lié à l’anticorps, qui a ensuite été lavé trois fois avec un tampon de lavage. L’ADN a été incubé à 65 ° C pendant au moins 2 h pour la décrochage. Enfin, l’ADN a été récupéré à l’aide d’un kit de purification par PCR (28104, Qiagen) et analysé par PCR semi-quantitative.

Dosage de la luciférase

Les cellules dérivées de HiPSC au jour 4 de la différenciation cardiaque ont été transfectées simultanément avec le vecteur rapporteur de luciférase de contrôle pGL3 de luciole (E1751, Promega, Madison, WI, USA) et le Sur Ren le plasmide rapporteur de luciférase pRL-TK (E2241, Promega) en utilisant le réactif de transfection FuGENE® HD (E2311, Promega).

Le système de dosage de la luciférase Dual-Glo® (E2920, Promega) a été utilisé pour détecter l’activité de la luciférase induite par le promoteur LPAR4 conformément au protocole du fabricant.

Animaux

Pour les expérimentations animales, 60 souris C57BL/6 de type sauvage ont été achetées chez Orient Bio (Seongnam-si, Séoul, Corée) et utilisées pour générer le modèle murin MI. Les souris ont été autorisées à s’adapter à l’animalerie pendant 7 jours avant les expériences. Toutes les souris étaient exemptes de virus murins, de bactéries pathogènes et d’endoparasites ainsi que d’ectoparasites. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC, IACUC no.: SNU-201028-3-1) de l’hôpital universitaire national de Séoul.

Modèle de souris de traçage de lignée et préparation d’échantillon d’ADN TG

La préparation d’ADN pour la microinjection du vecteur LPAR4_CreERT2_IRES_EGFP TG était la suivante:

L’ADN plasmidique LPAR4_CreERT2_IRES_EGFP pour microinjection comprenait un fragment (~6,6 kb) contenant le promoteur LPAR4. Les enzymes de restriction AfeI et Fspl (chacune située au début et à l’extérieur du promoteur) ont été utilisées pour fixer le fragment. Le fragment de squelette d’environ 1,9 kb a été excisé par extraction sur gel, suivie de l’introduction du fragment d’environ 6,6 kb.

Génération de souris TG

Les souris LPAR4_CreERT2_IRES_EGFP_TG ont été générées par Macrogen, Inc. (Séoul, Corée) et maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes. Toutes les manipulations ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de Macrogen (IACUC no. : 2018-01). Des souris femelles C57BL/6N ont été traitées avec PMSG et hCG pour la superovulation. PMSG (7,5 UI) et hCG ont été injectés par voie intrapéritonéale (ip) à intervalles de 48 h (5 UI) à des souris femelles âgées de 5 à 8 semaines. Après l’injection d’hCG, les souris femelles ont été accouplées avec des souris mâles étalons C57BL/6N. Le lendemain, après un contrôle d’imprégnation à l’aide d’un bouchon vaginal, des souris femelles ont été sacrifiées (comme méthode d’euthanasie, 5 à 6 mg de phénobarbital sodique ont été injectés par voie ip) et les embryons fécondés ont été récoltés. L’ADN de LPAR4_CreERT2_IRES_EGFP a été injecté dans des embryons unicellulaires. Des procédures de microinjection standard ont été utilisées pour la production de souris transgéniques (Macrogen, Inc.). L’ADN (4 ng/μL) a été directement injecté dans le pronoyau mâle du zygote à l’aide d’un micromanipulateur, et les embryons microinjectés ont été incubés à 37 °C pendant 1 à 2 h. Au total, 14 à 16 embryons monocellulaires injectés ont été transplantés par des méthodes chirurgicales dans les oviductes de souris receveuses pseudo-gravides. Après la naissance de F0, le génotypage a été effectué à l’aide d’échantillons de coupe de queue et la présence du transgène a été confirmée à l’aide d’analyses PCR de leur ADN génomique (avant : 5′-CTGCAAGACAGGCAGACAAG-3′, inverse : 5′-CATTGCTGTCACTTGGTCGTG-3′).

Une greffe de moelle osseuse

Des souris de type sauvage C57BL/6 ont été irradiées de manière sublétale (7,5 Gray) à l’aide d’un irradiateur au césium-137 (IBL437C, CIS Bio, Inc., Codolet, France). Les souris donneuses (souris LPAR4_CreERT2_IRES_EGFP_TG) ont été euthanasiées et GFP⁺ Les cellules BM ont été collectées à partir du tibia et du fémur. Ensuite, 5 × 10⁷ GFP⁺ Les cellules BM ont été transplantées de manière systémique via la veine jugulaire chez des souris receveuses irradiées de manière sublétale (souris C57BL/6 de type sauvage). Nous avons utilisé un modèle de souris et effectué la ligature de l’artère interventriculaire antérieure gauche après BMT. Après 4 semaines de BMT, une analyse FACS a été réalisée contre GFP⁺CD45⁺ cellules pour mesurer le taux de prise de greffe du donneur.

analyses statistiques

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) utilisant des tests de comparaison multiple de Newman-Keuls a été utilisée pour comparer chaque groupe. Le logiciel GraphPad Prism v8 a été utilisé (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA), et un p-valeur < 0,01 a été considérée comme statistiquement significative.