2024-08-14 19:59:25
Approbation de l’éthique animale
Des souris femelles C57BL/6JJmsSlc âgées de six semaines ont été achetées auprès de Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japon). Toutes les souris ont été hébergées à l’Université de Nagoya sous une température constante (21-23 °C) et un cycle de 14 heures de lumière et 10 heures d’obscurité et ont reçu de la nourriture et de l’eau à volonté. Toutes les procédures impliquant des expériences sur des souris ont été approuvées par le Comité des expériences animales de l’Université de Nagoya (M230269-003) et réalisées conformément aux directives institutionnelles et nationales. Le compte-rendu des expériences animales est conforme aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org/arrive-guidelines).
Modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine
Des souris femelles C57BL/6JJmsSlc âgées de 6 semaines (Shizuoka, Japon) ont été anesthésiées avec un cocktail anesthésique combiné (0,3 mg/kg de poids corporel de médétomidine, 4 mg/kg de poids corporel de midazolam et 5 mg/kg de poids corporel de butorphanol) par injection intrapéritonéale, puis ont reçu une dose endotrachéale unique de 100 μg de bléomycine (Nippon Kayaku Co., Ltd., Japon) le jour -7. Les animaux témoins ont reçu du tampon phosphate salé (PBS) par la même voie.
Isolement et culture des mASC
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été obtenues à partir de souris. La graisse inguinale fraîche a été isolée à partir de souris en utilisant du PBS de Dulbecco (Gibco, Billings, MT, États-Unis). Le tissu adipeux a été coupé en petits morceaux puis digéré avec 2 mg/mL de collagénase de type I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) pendant 60 min à 37 °C sur un agitateur. Les cellules ont été remises en suspension après centrifugation à 1 500 tr/min pendant 5 min puis filtrées à travers un filtre à mailles de 0,22 μm (SLGV033RS, Millex-GV ; Merck Millipore Ltd., Burlington, MA, États-Unis) pour éliminer tout résidu de tissu. Après deux lavages, les cellules ont été remises en suspension dans du DMEM/F12 (11965-092 ; Gibco, Billings, MT, États-Unis) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (Gibco, Billings, MT, États-Unis) et ensemencées dans des flacons de culture tissulaire T75 (BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C. Les cellules flottantes ont été retirées après 24 h et le milieu a été changé après 3 jours. À 90 % de confluence, les cellules ont été détachées à l’aide de trypsine-EDTA à 0,25 % et passées.
Transplantation de cellules souches hématopoïétiques multicellulaires (mASC)
Français L’étiquetage a été réalisé à l’aide de QDs (800). Les mASC ont été incubés avec une solution de 8 nM de QD-R8 (Qdot 800 ITK(TM) carboxyl quantum dots, Q21371MP ; Invitrogen, Waltham, MA, États-Unis) pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Les mASC ont été collectés à l’aide d’une solution de trypsine-EDTA (1 ×) et suspendus dans du PBS. 135 μL de PBS et 15 μL d’héparine ont été préparés pour 1 × 106 mASC. 150 μL de la suspension cellulaire ainsi préparée ont été injectés par la veine de la queue chez des souris saines et des souris modèles de fibrose pulmonaire à la bléomycine.
Imagerie par fluorescence IVIS
L’imagerie par fluorescence in vivo des mASC marqués par des QD a été réalisée à l’aide d’un CT IVIS Spectrum (PerkinElmer, États-Unis) 10 min, 1 h, 3 h, 24 h, 48 h et 72 h après l’administration dans la veine de la queue. Pendant l’acquisition des images, les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane. Les paramètres d’imagerie étaient les suivants : longueur d’onde d’excitation, 745 nm ; longueur d’onde de fluorescence, 800 nm ; et temps d’exposition, 5 s. Le cœur, le poumon, le foie, le rein et la rate ont été excisés 3, 6 et 24 h après l’administration des cellules pour évaluer la dynamique in vivo de chaque organe et les images ont été capturées à l’aide d’un CT IVIS Spectrum. Les images ont été analysées et l’efficacité d’accumulation a été calculée en fonction de la région d’intérêt (ROI) dessinée.
Analyse CT aux rayons X
Un scanner à rayons X Latheta LCT-200 pour animaux de laboratoire a été utilisé pour l’analyse CT. Toutes les souris ont été anesthésiées avec de l’isoflurane pendant l’imagerie et placées dans un dispositif de 48 mm pour le champ de vision. Les conditions d’imagerie sont présentées dans le tableau 1. L’imagerie CT des mASC marquées avec des QD a été réalisée à l’aide d’un CT IVIS Spectrum (PerkinElmer, États-Unis) les jours 1, 3, 7 et 14 après l’administration dans la veine de la queue. Les images ont été analysées et le volume pulmonaire a été calculé sur la base du ROI dessiné. La plage des valeurs CT a été fixée entre −900 et −200 afin que les os et la graisse ne soient pas mesurés.
Tableau 1 Conditions d’imagerie par tomodensitométrie à rayons X.
Mesure de la concentration en protéine D du tensioactif
La trachée de la souris a été exposée les jours 3 et 5 après l’administration d’isoflurane, la surface trachéale supérieure a été fendue, une sonde a été insérée et la trachée a été ligaturée. Un total de 500 μL de PBS a été administré dans la trachée via la sonde. Une fois distribué dans les poumons, il a été rétrolavé puis recueilli dans un tube de 1,5 mm. Cette procédure a été répétée trois fois, pour un total de 1500 μL de PBS recueilli après lavage des poumons. Ce liquide de lavage alvéolaire recueilli a été immédiatement congelé à −80℃.
La concentration de SP-D dans le liquide de lavage alvéolaire a été mesurée à l’aide d’un kit ELISA Quantikine Mouse SP-D (Biotechne, Minneapolis, MN, États-Unis).
Nettoyage des tissus CUBIC
La solution CUBIC-L pour la délipidation et la décoloration a été préparée sous forme d’un mélange de 10 %/10 % (p/p) de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis)/N-butyldiéthanolamine (B0725 ; Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japon). La solution CUBIC-R a été préparée sous forme d’un mélange de 30 % (p/v) de nicotinamide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) et de 45 % (p/v) d’antipyrine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis).
Pour la clarification de l’organe entier, les poumons fixés au PFA à 4 % ont été lavés trois fois avec du PBS puis immergés dans une solution CUBIC-L (50 % (v/v) mélangée à de l’eau) pendant 6 h à 37 °C. Les organes ont ensuite été immergés dans une solution CUBIC-L à 37 °C pendant 48 h ; la solution a été renouvelée toutes les 24 h au cours de ce processus. Après décoloration et clarification des lipides, les organes ont été lavés avec du PBS à température ambiante (ou 21-23 °C) pendant 2 h, puis immergés dans la solution CUBIC-R (50 % (v/v) mélangée à de l’eau) pendant 6 h à température ambiante. Enfin, les organes ont été immergés et stockés toute la nuit dans la solution CUBIC-R à température ambiante. Après clarification du tissu, des mesures ont été effectuées à l’aide d’un microscope à feuillet lumineux (UltraMicroscope II ; Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Allemagne).
Analyses statistiques
Les valeurs numériques sont présentées sous la forme de moyenne ± écart type (ET). Chaque expérience a été répétée trois fois. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’un test t de Student non apparié pour les comparaisons entre les deux groupes ; valeurs p
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