Il est difficile d’étudier l’hétérogénéité de la biologie. Les méthodes de base, telles que la moyenne des données, peuvent masquer la variabilité. Même des méthodes assez avancées, telles que le séquençage en masse, peuvent faire de même. Comme l’indique le « volume » du séquençage en masse, il combine des cellules de types variés en un seul échantillon à des fins d’analyse, réalisant ainsi un autre type de moyenne. Heureusement, les recherches sur l’hétérogénéité biologique commencent à tirer parti des technologies de séquençage unicellulaire et d’omique spatiale. En effet, l’hétérogénéité biologique a moins d’endroits où se cacher maintenant que ces technologies peuvent pénétrer différents « omes » comme le génome, le transcriptome et le protéome. Il existe même des technologies qui englobent plusieurs domaines.
Il faut toutefois veiller à ce que l’hétérogénéité biologique ne passe pas inaperçue simplement parce que les technologies permettant de la sonder sont négligées ou sous-utilisées. Plusieurs de ces technologies sont envisagées dans cet article. La plupart conviennent au déploiement en interne. Certains peuvent être plus facilement accessibles via des fournisseurs de services. Dans les deux cas, ils peuvent aider les enquêteurs à renverser la tyrannie des moyennes qui règne dans de nombreux domaines de la biologie.
Séparer les cellules
Avant de travailler sur des cellules individuelles, les scientifiques doivent les collecter. Certaines techniques séparent les cellules à haute pression, tandis que d’autres utilisent des étiquettes pour permettre l’identification et l’extraction de cellules spécifiques. Les scientifiques de LevitasBio à Menlo Park, en Californie, ont développé une plateforme qui utilise un toucher plus léger. La plateforme s’appelle LeviCell. (Ce nom, comme le nom de l’entreprise, tire « levi » de « lévitation ».)
“[LeviCell] utilise des champs magnétiques pour enrichir les cellules sans étiqueter directement les cellules ni utiliser toute autre manipulation directe des cellules », explique Kevin Travers, PhD, vice-président senior de la R&D chez LevitasBio. “C’est un processus très doux.”
Un échantillon de cellules et une solution paramagnétique – essentiellement une concoction faiblement magnétique – sont introduits dans une cartouche LeviCell, dirigés vers un canal de séparation et soumis à un « champ de densité magnétique ». Dans le canal de séparation, des cellules de différents types lévitent à différentes hauteurs.
«C’est vraiment un effet indirect», souligne Travers. “Les cellules sont différentes de la solution et elles sont poussées vers le haut et éloignées des bords de la chambre à sustentation magnétique.” Une vue en temps réel permet à un scientifique d’observer les cellules pendant qu’elles lévitent au sein de la plateforme LeviCell, puis de déterminer comment les cellules sont séparées en puits.
“Les canaux d’écoulement de notre système sont très grands, ce qui nous permet de manipuler de très gros objets”, explique Travers. “Ainsi, la même technologie peut fonctionner avec tout, depuis les cellules bactériennes jusqu’aux éléments aussi gros que les organoïdes.” Le système est conçu pour collecter des objets d’un diamètre allant jusqu’à 350 μm. De plus, LeviCell fonctionne avec une large gamme de numéros de cellules. Les scientifiques de LevitasBio ont travaillé avec succès avec quelques milliers, voire des millions de cellules.
À partir de ces échantillons, les scientifiques peuvent ensuite « analyser l’état d’expression génique des cellules aussi près que possible de leur état natif », affirme Travers. “Cela permet finalement aux chercheurs d’être plus sûrs que ce qu’ils examinent sont les données les plus propres possibles en supprimant le bruit qui accompagne les cellules mortes et les débris inhérents à un grand nombre de ces échantillons cellulaires.”
Séquençage de cellules uniques
Après avoir collecté des cellules, un scientifique souhaitera peut-être les séquencer une par une. Cela peut se concentrer sur le séquençage de l’ADN unicellulaire ou le séquençage de l’ARN (scDNA-seq et scRNA-seq, respectivement). Ce n’est pas facile à faire, surtout à haut débit. Au lieu d’effectuer ces processus en interne, une entreprise peut travailler avec un organisme de recherche sous contrat (CRO).
En juillet 2023, l’organisme de recherche sous contrat Single Cell Discoveries a quitté l’incubateur de l’Institut Hubrecht pour s’installer dans ses propres installations à Utrecht, aux Pays-Bas. Le nouveau laboratoire de séquençage de la société comprend un NovaSeq X Plus d’Illumina et un Chromium X de 10x Genomics (illustré ici). Grâce à sa collection de plates-formes, Single Cell Discoveries peut séquencer l’ARN de cellules uniques à différentes échelles.
Par exemple, Single Cell Discoveries, une CRO située à Utrecht, aux Pays-Bas, exploite un laboratoire développé spécifiquement pour le séquençage unicellulaire. «Nous sommes indépendants de la plate-forme et offrirons les technologies unicellulaires de la plus haute qualité et les plus demandées», déclare Dylan Mooijman, PhD, responsable de la R&D chez Single Cell Discoveries. « Nos technologies sont divisées entre des méthodes de séquençage d’ARNc basées sur des plaques de 384 puits que nous développons nous-mêmes (SORT-seq et VASA-seq) et des méthodes de séquençage d’ARNc à haut débit disponibles dans le commerce, telles que celles de 10x Genomics, Parse Biosciences. et Scale Biosciences.
Grâce au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), Single Cell Discoveries place une cellule dans chaque puits d’une plaque. “Ensuite, l’ARN de ces cellules uniques peut être directement transcrit de manière inverse ou manipulé pour produire un séquençage d’ARN unicellulaire de 3 ¢ (SORT-seq) ou complet (VASA-seq),” explique Mooijman. « Les méthodes scRNA-seq à haut débit sont soit basées sur des gouttelettes, soit reposent sur la fixation et le codage à barres combinatoire. » Il ajoute : « VASA-seq permet la détection du transcriptome complet », y compris les petits ARN nucléaires (snARN) et les petits ARN nucléolaires (snoARN).
Les découvertes de cellules uniques peuvent séquencer diverses quantités d’ARN dans jusqu’à un million de cellules en une seule fois. “Les méthodes à haut débit ont généralement une sensibilité légèrement inférieure, mais compensent cela par le nombre”, note Mooijman. « Ces méthodes à haut débit garantissent une couverture suffisante pour séquencer plusieurs ARN guides ciblant environ 16 000 gènes dans une expérience sur une seule cellule. »
Dans de nombreuses situations, les scientifiques souhaitent explorer le système immunitaire dans le cadre de recherches fondamentales et appliquées. Pour y parvenir, Single Cell Discoveries développe une méthode qui utilise des plaques à 384 puits pour profiler les cellules immunitaires d’un échantillon. Grâce à cette méthode, les scientifiques pourront séquencer les récepteurs complets des lymphocytes T et des lymphocytes B à partir d’un petit nombre de cellules.
“De nombreuses méthodes de sélection de cellules immunitaires aboutissent à seulement 100 à 300 cellules, ce qui n’est suffisant pour aucune méthode de profilage immunitaire actuelle”, souligne Mooijman. « En proposant une méthode adaptée à ce besoin, nous espérons faire progresser la recherche sur la découverte d’anticorps et la recherche sur les récepteurs des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. »
Ajouter de l’imagerie aux omiques
C’est une chose d’analyser les caractéristiques omiques d’une seule cellule, et une autre de déterminer simultanément l’emplacement de cette cellule. Pour faire les deux, les scientifiques doivent ajouter une forme d’imagerie.
À titre d’exemple, Singular Genomics, basée à San Diego, en Californie, a récemment annoncé sa plateforme de séquençage spatial G4X. Pour proposer cette technologie, la société a combiné sa chimie de séquençage par synthèse (SBS) et sa plateforme d’imagerie à grande vitesse avec de nouvelles méthodes permettant un séquençage résolu spatialement à l’intérieur des cellules et des tissus. “Nous avons compris comment appliquer le séquençage SBS à la lecture in situ des transcrits d’ARN et des protéines dans une coupe de tissu FFPE à haut débit avec une résolution d’un demi-micron.” déclare Drew Spaventa, PDG de Singular Genomics. Étant donné que le G4X peut collecter plus de deux milliards de pixels par seconde tout en couvrant une zone d’imagerie de 40 cm2, il peut traiter des dizaines d’échantillons en une seule journée.
“En séquençant l’ARN in situ, les chercheurs peuvent analyser les fusions de gènes, les polymorphismes mononucléotidiques et les insertions/délétions dans un contexte spatial avec d’autres données multiomiques”, remarque Spaventa. “Cette application sera particulièrement puissante pour la recherche sur le cancer et l’immunologie, en fournissant une image plus complète du microenvironnement tumoral et des interactions cellulaires.” Il affirme également que le débit sans précédent du système est particulièrement adapté à la caractérisation spatiale rétrospective à grande échelle des banques de tissus pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et la stratification de la réponse thérapeutique.
Localisation des biomarqueurs protéiques
Outre les technologies permettant de déterminer les emplacements de l’ADN et de l’ARN, il existe des technologies permettant de déterminer l’emplacement des protéines. Par exemple, une technologie de localisation de protéines appelée CellScape a été développée par Canopy Biosciences, une société Bruker à Saint Louis, MO. « CellScape est une plateforme d’imagerie pour un multiplexage spatial précis », déclare Thomas Campbell, PhD, directeur associé de la gestion des produits chez Canopy.
“Historiquement, si les gens voulaient examiner de nombreux biomarqueurs protéiques sur un échantillon de tissu, ils avaient deux options”, poursuit Campbell. « Vous pourriez prendre plusieurs sections de votre tissu et examiner deux ou trois marqueurs par section, ou vous pourriez broyer ce tissu et ensuite effectuer un test plus complexe, tel que la cytométrie en flux, mais vous perdriez alors le contexte spatial – à quel point les cellules interagissent les unes avec les autres et comment elles sont distribuées spatialement au sein de l’échantillon.
En avril, Canopy Biosciences a lancé sa chambre d’imagerie CellScape Whole-Slide, qui fonctionne avec la plateforme de multiplexage spatial précis CellScape de la société. Dans l’exemple présenté ici, les scientifiques ont utilisé CellScape pour fournir une imagerie haute résolution d’un ensemble de cibles dans des microréseaux de tissus humains.
Avec CellScape, un scientifique peut analyser des dizaines et des dizaines de biomarqueurs protéiques dans une seule coupe de tissu, le tout sans perturber aucune information spatiale. “Et nous pouvons le faire avec une résolution unicellulaire”, affirme Campbell. “Ainsi, vous pouvez phénotyper chaque cellule en profondeur et commencer à comprendre tous les différents types et sous-types de cellules présents dans un échantillon et comment ils interagissent les uns avec les autres, le tout de manière vraiment quantitative.”
Pour ce faire, CellScape utilise l’acquisition d’images HDR (High Dynamic Range) exclusive à la société, qui offre une plage de détection de 8 log et est combinée à une résolution numérique de 182 nm/pixel. « Nous prenons la même image plusieurs fois en utilisant des temps d’exposition différents », explique Campbell. « Cela nous permet de quantifier des signaux très brillants en utilisant des temps d’exposition courts et de quantifier des signaux très faibles en utilisant des temps d’exposition longs. Nous pouvons créer une image composite qui a une plage dynamique plus large et vous permet de quantifier véritablement les cellules à expression élevée et faible au sein du même échantillon, et de réellement différencier les cellules in situ sur toute la plage d’expression. De plus, comme le flux de travail n’est pas destructeur pour l’échantillon, la même coupe de tissu peut être réexaminée la semaine, le mois ou même l’année suivante pour étudier des biomarqueurs protéiques supplémentaires.
Selon Campbell, grâce à cette combinaison de capacités, « nous disposons de données plus représentatives de la biologie en cours, ce qui contribuera à alimenter les découvertes dans un large éventail d’applications. »
2024-06-01 13:47:10
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