Résumé: Les chercheurs ont développé une méthode pour analyser les vésicules extracellulaires (VE) dans le sang afin de détecter précocement la maladie de Parkinson (MP). En isolant les véhicules électriques et en évaluant leur contenu, l’équipe a identifié une protéine appelée α-synucléine phosphorylée qui apparaît à des niveaux élevés chez les patients parkinsoniens.
Cette découverte pourrait permettre un diagnostic plus précoce, car ces modifications protéiques sont détectables avant l’apparition des symptômes cliniques. L’approche utilise un test ultra-sensible capable de distinguer les marqueurs de maladie présents dans les véhicules électriques de ceux libres dans le plasma.
En cas de succès, cette technique pourrait permettre un diagnostic sanguin non invasif de la MP et d’autres troubles neurodégénératifs. Les travaux en cours détermineront si le test peut différencier de manière fiable la MP d’autres conditions.
Faits clés :
- Des niveaux élevés d’α-synucléine phosphorylée dans les véhicules électriques sont en corrélation avec la progression de la MP.
- Les vésicules extracellulaires protègent les biomarqueurs protéiques, contribuant ainsi à préserver les indicateurs de maladie.
- Cette technique de diagnostic basée sur le sang peut permettre une détection précoce et non invasive de la MP.
Les troubles cérébraux comme la maladie de Parkinson (MP) ou la maladie d’Alzheimer (MA) commencent à se développer chez les patients beaucoup plus tôt que l’apparition de leurs premiers symptômes cliniques.
Traiter les patients à ces stades précoces pourrait ralentir, voire arrêter leur maladie, mais il n’existe actuellement aucun moyen de diagnostiquer les troubles cérébraux à ces stades pré-symptomatiques.
Jusqu’à présent, les lésions cérébrales spécifiques provoquées par la MP, par exemple, ne peuvent être détectées qu’en analysant des biopsies cérébrales, qui ne peuvent être obtenues qu’à titre posthume.
En analysant une cohorte d’échantillons de patients, ils ont pu détecter un enrichissement de la protéine pathologique ⍺-synucléine à l’intérieur des EV par rapport au plasma total. Crédit : Actualités des neurosciences
Pour surmonter ce goulot d’étranglement critique, les chercheurs ont étudié le nouveau concept de « biopsies liquides », qui implique l’extraction facile de sang ou d’autres fluides corporels à l’aide de procédures non invasives, et leur analyse à la recherche de molécules provenant du cerveau et d’autres tissus solides.
Les « vésicules extracellulaires » (VE), de minuscules sacs liés à la membrane libérés par le cerveau et d’autres cellules dans les fluides environnants, sont une cible particulièrement prometteuse dans les fluides corporels.
Ces sacs contiennent une variété de molécules qui peuvent être uniques aux types de cellules qui les produisent, comme le cerveau, et pourraient donc également contenir des biomarqueurs protégés pour l’apparition précoce de la maladie de Parkinson et d’autres maladies cérébrales.
Cependant, malgré les progrès récents, les experts en VE n’ont pas été en mesure de résoudre le problème de savoir si les molécules biomarqueurs particulières qu’ils ont mesurées dans des VE isolés sont strictement contenues à l’intérieur des VE ou non spécifiquement liées à leur surface.
Ce défi les a en fait empêchés de tirer des conclusions sans ambiguïté sur les molécules cargo présentes dans les véhicules électriques à partir de tous les types de tissus.
Désormais, une équipe collaborative dirigée par David Walt, Ph.D. au Wyss Institute de l’Université Harvard et au Brigham and Women’s Hospital (BWH) de Boston a résolu ce problème en ajoutant une étape cruciale à un protocole ultra-sensible déjà validé.
En digérant de manière enzymatique toutes les protéines liées à la surface d’une population de véhicules électriques purifiée, ils ont pu cibler spécifiquement les marchandises protégées à l’intérieur des véhicules électriques tout en éliminant les « contaminations » non spécifiques.
En utilisant leur protocole amélioré pour mesurer le biomarqueur PD ⍺-synucléine dans le sang, ils ont pu pour la première fois déterminer avec précision la petite fraction de toute protéine contenue dans les véhicules électriques par rapport à la quantité présente gratuitement dans le plasma sanguin total.
En analysant une cohorte d’échantillons de patients, ils ont pu détecter un enrichissement de la protéine pathologique ⍺-synucléine à l’intérieur des EV par rapport au plasma total. Les résultats sont publiés dans PNAS.
« La recherche sur les véhicules électriques dans notre groupe et dans d’autres au cours des dernières décennies a progressivement fait progresser notre compréhension de leur biologie complexe et de leur composition moléculaire.
“Pourtant, l’isolement de véhicules électriques purement spécifiques à des tissus à partir de fluides corporels comme le sang ou le liquide céphalo-rachidien entourant le système nerveux central, y compris le cerveau, ainsi que la validation et la quantification de leur véritable contenu avec des mesures précises présentent encore de formidables défis techniques”, a déclaré Wyss Core. Walt, membre du corps professoral.
«Nos travaux récents fournissent une solution pour combler cette lacune technologique et nous rapprochent de la possibilité d’obtenir des véhicules électriques exempts de contamination afin de les utiliser comme sources riches de biomarqueurs cliniques, comme nous le montrons avec l’exemple des ⍺- phosphorylés. synucléine.
Walt, qui dirige le corps professoral de l’accélérateur de diagnostic du Wyss Institute, est également professeur Hansjörg Wyss d’ingénierie d’inspiration biologique à la Harvard Medical School (HMS), professeur de pathologie au Brigham and Women’s Hospital et professeur au Howard Hughes Medical Institute.
Du sang aux véhicules électriques, en passant par les biomarqueurs et le diagnostic
Particulièrement motivé par la promesse diagnostique des véhicules électriques pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson, de la maladie d’Alzheimer et d’autres troubles cérébraux, le groupe Walt a systématiquement rempli les pièces vitales de ce puzzle technique.
Leur méthodologie combine une technique de séparation connue sous le nom de chromatographie d’exclusion de taille (SEC) pour récupérer la plupart des EV à partir de biofluides avec des « tests Simoa » ultra-sensibles qui leur ont permis de compter les molécules protéiques uniques associées aux EV qu’ils ont capturées et visualisées avec des anticorps spécifiques.
À l’heure actuelle, l’équipe a conçu des tests Simoa pour une variété de biomarqueurs spécifiques aux véhicules électriques et, surtout, a exclu une protéine de surface candidate largement utilisée, L1CAM, comme cible pour isoler les véhicules électriques spécifiques au cerveau, ce qui a fourni au domaine une correction de cap importante. .
En utilisant ce test dans leur protocole, l’équipe a pu déterminer que la majeure partie de la ⍺-synucléine dans les véhicules électriques isolés à l’aide de leur protocole SEC était protégée et que cette quantité représentait moins de 5 % de la ⍺-synucléine totale du plasma sanguin.
Comprendre cette quantité est particulièrement important pour l’objectif final de mesurer la ⍺-synucléine dans les véhicules électriques dérivés de neurones, car les véhicules électriques provenant d’un tissu spécifique comme le cerveau devraient être rares par rapport aux véhicules électriques provenant des cellules sanguines, où la ⍺-synucléine est également exprimée. .
Surtout, en plus de leur test Simoa ultra-sensible qui leur a permis de détecter la protéine ⍺-synucléine normale non modifiée, ils ont également développé un test capable de détecter la ⍺-synucléine qui devient phosphorylée sur un site spécifique (pSer129) au cours du processus. de la progression de la MP.
«Lorsque nous avons appliqué notre méthodologie avancée à une cohorte d’échantillons de sang obtenus auprès de patients atteints de MP et de démence à corps de Lewy ainsi que de donneurs témoins sains, nous avons constaté que le rapport entre la ⍺-synucléine phosphorylée et la ⍺-synucléine totale était de deux à trois. plier plus haut à l’intérieur des véhicules électriques par rapport à l’extérieur des véhicules électriques », a déclaré Gilboa.
“C’était extrêmement excitant car cela suggère que les véhicules électriques pourraient protéger l’état de phosphorylation des protéines des phosphatases en circulation qui, autrement, effaceraient cette marque hautement informative.”
L’équipe étudie désormais plus en détail si ces tests pourraient être utilisés pour différencier les patients parkinsoniens des personnes non atteintes de la maladie.
« Les travaux de l’équipe de David Walt constituent un tour de force technologique qui nous rapproche de plus en plus d’une plateforme de diagnostic de nouvelle génération au potentiel extraordinaire. À ce stade, nous ne sommes pas loin d’utiliser ces vésicules dérivées de cellules extrêmement riches et révélatrices comme fenêtre permettant d’accéder au cerveau des patients sans nécessiter de chirurgie », a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., qui est également professeur Judah Folkman de biologie vasculaire au HMS et au Boston Children’s Hospital et professeur Hansjörg Wyss d’ingénierie d’inspiration biologique à la John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences de Harvard.
Les autres auteurs de l’article sont George Church, Ph.D., membre du corps professoral de Wyss et professeur de génétique Robert Winthrop à HMS, et Alice Chen-Plotkin, MD, professeur de neurologie de la famille Parker à la Perelman School of Medicine de Université de Pennsylvanie, Philadelphie, qui ont tous deux collaboré avec le groupe de Walt depuis le début du projet EV, ainsi que George Kannarkat.
Financement: Le travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Michael J. Fox (Grant #2021A017224), du Chan Zuckerberg Initiative NeuroDegeneration Challenge Network et de Good Ventures. Gilboa est lauréate du prix de développement de carrière postdoctorale des femmes de l’Institut Weizmann des sciences.
À propos de cette actualité sur la recherche sur la maladie de Parkinson
Recherche originale : Accès fermé.
“Mesure de l’α-synucléine en tant que cargaison protéique dans les vésicules extracellulaires plasmatiques» de David Walt et coll. PNAS
Abstrait
Mesure de l’α-synucléine en tant que cargaison protéique dans les vésicules extracellulaires plasmatiques
Les vésicules extracellulaires (VE) sont libérées par toutes les cellules et sont très prometteuses en tant que classe de biomarqueurs. Cette promesse a suscité un intérêt accru pour la mesure des protéines EV provenant à la fois des EV totaux et des EV dérivés du cerveau dans le plasma.
Cependant, mesurer les protéines cargo dans les véhicules électriques a été difficile car les véhicules électriques sont présents à de faibles niveaux et les méthodes d’isolement des véhicules électriques sont imparfaites pour séparer les véhicules électriques des protéines libres. Ainsi, il est difficile de savoir si une protéine mesurée après l’isolement des véhicules électriques se trouve réellement à l’intérieur des véhicules électriques.
Dans cette étude, nous avons développé des méthodes pour mesurer si une protéine se trouve à l’intérieur des EV et quantifier le rapport d’une protéine dans les EV par rapport au plasma total.
Pour y parvenir, nous avons combiné un protocole de chromatographie d’exclusion de taille à haut rendement avec un test optimisé de protection des protéases et des tests immunoenzymatiques numériques (ELISA) à matrice unique de molécules (Simoa) pour une mesure ultrasensible des protéines à l’intérieur des véhicules électriques.
Nous avons appliqué ces méthodes pour analyser l’α-synucléine et confirmé qu’une petite fraction de l’α-synucléine plasmatique totale se trouve à l’intérieur des véhicules électriques. De plus, nous avons développé un test Simoa très sensible pour l’α-synucléine phosphorylée (phosphorylée au niveau du résidu Ser129).
Nous avons constaté un enrichissement du rapport entre l’α-synucléine phosphorylée et l’α-synucléine totale à l’intérieur des véhicules électriques par rapport aux véhicules électriques extérieurs.
Enfin, nous avons appliqué les méthodes que nous avons développées pour mesurer l’α-synucléine totale et phosphorylée dans les véhicules électriques provenant d’échantillons de patients atteints de la maladie de Parkinson et de démence à corps de Lewy.
Ce travail fournit un cadre pour déterminer les niveaux de protéines dans les EV et représente une étape importante dans le développement de diagnostics EV pour les maladies du cerveau, ainsi que d’autres organes.
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